包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的制备方法及该细胞团块技术方案

本发明专利技术的课题在于提供由多潜能干细胞有效地制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的手段。细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(1)及(2)：(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的制备方法及该细胞团块
本专利技术涉及由多潜能干细胞制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的方法及该细胞团块。
技术介绍
在非专利文献1中，报告了通过将由人iPS细胞制作的聚集体在Wnt信号转导途径抑制物质及源自小鼠肉瘤的基膜制剂(基质胶)的存在下悬浮培养，制作了人角膜类器官。然而，从避免异种成分及未确定因素的混入的观点出发，迫切期望也可以不使用源自小鼠肉瘤的基膜制剂的包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的制备方法。在非专利文献2中，报告了将人iPS细胞在平面上贴壁培养，制作了立体的晶状体。在非专利文献3中，报告了将人iPS细胞在平面上贴壁培养，二维地形成了包含中枢神经，视网膜，角膜，晶状体，表皮的集群。然而，迫切期望通过不需要实施有特定处理的容器，并能够容易地扩大规模的悬浮培养，有效地制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的方法。在专利文献1中，报告了通过在不存在Wnt信号转导途径抑制物质的条件下使细胞的聚集体形成，使得到的聚集体与5nM的BMP4进行长时间作用，在无血清培养基中悬浮培养，由此立体地形成了角膜、晶状体等前眼部组织。然而，由于重组蛋白质(BMP4)的价格昂贵，因此迫切期望也可以不将重组蛋白质以高浓度长时间使用的制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2015/020091>非专利文献非专利文献1：Fosteretal.ScientificReports，7，2017.非专利文献2：Fuetal.InvestigativeOphthalmology&VisualScience，58.1，2017∶517-527.非专利文献3：Hayashietal.Nature，531.7594，2016∶376-380.
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的目的在于提供由多潜能干细胞有效地制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的手段。特别是提供通过可以将经无饲养细胞条件下培养的多潜能干细胞作为起始材料，降低昂贵的重组蛋白质的使用量由此进行便宜的制备，由此有效地制备细胞团块的手段。解决问题的手段本专利技术人在为解决上述问题进行反复研究时，发现通过在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，添加BMP信号转导途径作用物质，由此可有效地制备一并包含神经组织、神经系统细胞和非神经上皮组织的细胞团块。进一步发现，通过将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，用1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径作用物质处理，可改善细胞团块的制备效率。此外，通过将BMP信号转导途径作用物质的添加条件最优化，鉴定从悬浮培养开始72小时以内的所谓最适添加时期，成功进行了通过比以往更低浓度的BMP4导致的包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的诱导分化。即，本专利技术涉及以下内容。[1]细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(1)及(2)；(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。[2]细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(a)、(1)及(2)；(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中维持培养，(1)第一步骤，将在a步骤中维持培养的多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成，(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。[3]根据上述[1]或[2]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(2)中的BMP信号转导途径作用物质在从上述步骤(1)中多潜能干细胞的悬浮培养开始时的0.5小时以后72小时以内进行添加。[4]根据上述[1]或[2]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(2)中的BMP信号转导途径作用物质在由上述步骤(1)形成的聚集体的表层的细胞的1成以上形成紧密连接的时期内进行添加。[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述BMP信号转导途径作用物质为选自：BMP2，BMP4，BMP7，BMP13及GDF7中的至少一种蛋白质。[6]根据上述[1]～[4]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述BMP信号转导途径作用物质为BMP4。[7]根据上述[6]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(2)中的悬浮培养在上述BMP4的浓度为10pM～5nM的培养基中进行。[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径抑制物质具有对于非经典Wnt途径的抑制活性。[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径抑制物质为PORCN抑制剂。[10]根据上述[9]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述PORCN抑制剂为选自：IWP-2，IWP-3，IWP-4，IWP-L6，IWP-12，LGK-974，Wnt-C59，ETC-159及GNF-6231中的至少一种化合物。[11]根据上述[1]～[7]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径抑制物质为TANK抑制剂。[12]根据上述[11]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述TANK抑制剂为选自IWR1-endo，XAV939及MN-64中的至少一种化合物。[13]根据上述[1]～[12]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(1)和/或上述步骤(2)中的培养还在TGFβ信号转导途径抑制物质的存在下进行。[14]根据上述[13]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述TGFβ信号转导途径抑制物质为Alk5/TGFβRl抑制剂。[15]根据上述[14]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述Alk5/TGFβR1抑制剂为选自：SB431542，SB505124，SB525334，LY2157299，GW788388，LY364947，SD-208，EW-7197，A83-01及RepSox中的至少一种化合物。[16]根据上述[2]～[15]中任一项所述的细胞团块本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(1)及(2)：/n(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；/n(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171124 JP 2017-2263081.细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(1)及(2)：
(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；
(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。


2.细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(a)、(1)及(2)：
(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中维持培养，
(1)第一步骤，将在a步骤中维持培养的多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成，
(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。


3.根据权利要求1或2所述的细胞团块的制备方法，其中，所述Wnt信号转导途径抑制物质为PORCN抑制剂。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，所述步骤(1)和/或步骤(2)中的培养还在TGFβ信号转导途径抑制物质的存在下进行。


5.细胞团块，其为根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法得到的包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。


6.非神经上皮组织片的制备方法，包括下述步骤(1)～(4)：
(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；
(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块；
(3)第三步骤，从第二步骤得到的细胞团块回收2)非神经上皮组织；
(4)第四步骤，使第三步骤得到的2)非神经上皮组织分散，在平面上培养，由此得到非神经上皮组织片。


7.非神经上皮组织片的制备方法，包括下述步骤(a)及下述步骤(1)～(4)：
(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TG...

【专利技术属性】
技术研发人员：中野德重，
申请(专利权)人：住友化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP