一种双基团光敏明胶的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种双基团光敏明胶的制备方法和应用，属于生物材料技术领域。所制备的明胶分子骨架上拥有两种光敏基团，分别为甲基丙烯基团和降冰片烯基团，降冰片烯的引入，能够改善细胞在凝胶中的增殖情况，此外，利用巯基和降冰片烯高反应活性的特点，可以将多种类型的带有巯基的分子引入凝胶体系中，使该凝胶有了更大的改造空间。

【技术实现步骤摘要】
一种双基团光敏明胶的制备方法和应用
本专利技术涉及生物材料
，具体涉及一种双基团光敏明胶的制备方法和应用。
技术介绍
近年来，三维培养体系得到了越来越多的重视，研究发现，在传统的二维培养体系中，细胞无论是外观形貌，还是基因表达，都与其在体内的状态差异巨大。研究表明，三维培养取得的实验结果更加接近于体内的实验结果。目前，已经有众多商品化的培养体系被广泛应用，如matrigel、collagen、alginate等。其中，甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)因其生物相容性良好、成型速度快、凝胶结构强度高等优点，被广泛应用于3D培养系统中。但是，甲基丙烯酸酐改性明胶仍然存在一定的缺点，其交联后的分子网络过于紧密，严重影响细胞在其中的伸展和增殖。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种双基团光敏明胶的制备方法和应用，该方法能够将甲基丙烯基团和降冰片烯基团同时引入明胶的分子长链上，改善了细胞在其中的增殖能力，采用该双基团明胶更方便的使各种带有巯基的分子修饰于凝胶骨架上，从而构建各种功能性的三维培养体系。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种双基团光敏明胶的制备方法，该方法包括如下步骤：(1)甲基丙烯酸酐改性明胶的制备：称取一定量的明胶加入PBS缓冲液中，加热至60℃至明胶完全溶解，得到明胶溶液；待明胶溶液降温至50℃，加入改性剂甲基丙烯酸酐，在50℃和搅拌条件下反应1小时；加入为反应液2倍体积的4℃预冷的PBS，终止反应；将所得溶液使用透析袋透析72h，透析温度40℃；透析完成后，取出冻干，获得所述甲基丙烯酸酐改性明胶；(2)双基团光敏明胶的制备：将步骤(1)所得甲基丙烯酸酐改性明胶重新溶解于50℃的PBS缓冲液中，得到甲基丙烯酸酐改性明胶溶液；然后加入改性剂降冰片烯二酸酐，搅拌条件下，使用氢氧化钠溶液调节溶液pH值至8-9，反应1h后，使用为反应液5倍体积的4℃预冷PBS终止反应；离心去除未溶解的杂质后，40℃条件下透析72小时，冻干，即得到所述双基团光敏明胶。上述步骤(1)中，所述明胶溶液中的明胶与PBS缓冲液的比例为0.1g：1mL；所加入的甲基丙烯酸酐的体积为明胶溶液体积的1-10％。上述步骤(2)中，所述甲基丙烯酸酐改性明胶溶液中的甲基丙烯酸酐改性明胶与PBS缓冲液的比例为0.1g：1mL；所加入的降冰片烯二酸酐的质量为甲基丙烯酸酐改性明胶溶液质量的1-20％。上述步骤(2)中，用于调节溶液pH值的氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L。所述PBS缓冲液的浓度为10mmol/L，pH值为7.2-7.4。所制备的双基团光敏明胶用于构建三维培养体系，三维培养体系的构建过程如下：将所述双基团光敏明胶溶解于PBS缓冲液中，得到双基团光敏明胶溶液；然后加入光引发剂和带有巯基的化合物，所得混合物料采用孔径0.22微米的微孔滤膜过滤除菌后，得到体系A；将含有细胞的培养基加入体系A中并混合均匀，得到体系B；最后将体系B使用365nm波长的紫外光照射5-100s，得到功能化的凝胶，该功能化的凝胶即为所述三维培养体系。所述带有巯基的化合物为生长因子、蛋白、多肽和药物中的一种或几种(如bFGF生长因子、一抗、末端带有巯基的RGD多肽等以及合成的末端带有巯基的金属蛋白酶降解多肽、二硫苏糖醇、以及末端修饰巯基的聚乙二醇等)，化合物中的巯基和降冰片烯反应迅速，能使带有巯基的化合物分子固定于凝胶骨架上。所述细胞为各种原代细胞、细胞系或基因改造细胞(如骨髓间充质干细胞、成纤维细胞、MC3T3-e1细胞、表达荧光蛋白的血管内皮细胞等)。所述双光敏基团明胶与PBS缓冲液的比例为(0.05-0.2)g：1mL；所述光引发剂的加入量与双基团光敏明胶溶液的比例为(0.5-5)mg：1mL，所述光引发剂为LAP或I2959；所述带有巯基的化合物在明胶溶液中的浓度为0.01-50mmol/L；所述培养基体积为体系A体积的1-10％，所述体系B中的细胞终浓度为103-107个/mL；所述紫外光的强度为1-100mW/cm2。本专利技术设计机理如下：本专利技术首先制备了低取代度的甲基丙烯酸酐改性明胶，甲基丙烯间的反应迅速，且结构稳定性较高，有利于凝胶的快速成型。该反应完成后，明胶分子链上仍然有大量未反应的氨基(NH2-)，又将降冰片烯继续连接至明胶分子链中。降冰片烯间通过自由基聚合的强度低于甲基丙烯基团，改善了细胞在其中的增殖能力。此外，巯基和降冰片烯反应活性极高，该反应属于点击化学的一种类型，能够方便的使各种带有巯基的分子修饰于凝胶骨架上，包括双巯基的交联剂，带有巯基的活性多肽、被巯基修饰的各种高分子等，本专利技术所述的双基团明胶，具有极大地改造空间，通过引入上述不同种类的带有巯基的分子，得到不同性能的功能材料。本专利技术的优点和有益效果如下：1、本专利技术制备的凝胶系统中，降冰片烯间通过自由基聚合的强度低于甲基丙烯基团，改善了细胞在其中的增殖能力。2、本专利技术制备的凝胶系统中，巯基和降冰片烯反应活性高，能够方便的使各种带有巯基的分子修饰于凝胶骨架上，使该凝胶成为平台级的三维培养体系。附图说明图1为实施例1制备的双基团明胶的核磁谱图。图2为兔骨髓间充质干细胞在双基团明胶中生长。图3为合成多肽RhodamineB-GGKGRGDCG标记的固化后的双基团明胶。具体实施方式以下通过实施例详述本专利技术。以下实施例中，用于调节溶液pH值的氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，所用PBS缓冲液的浓度为10mmol/L，pH值为7.4。实施例1：本实施例制备双基团光敏明胶的过程如下：1、甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)的制备：称取一定量的明胶溶于PBS缓冲液中，明胶与PBS缓冲液比例为0.1g：1mL。加热至60℃，约2小时后，待明胶完全溶解，降温至50℃；加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐的加入体积为明胶溶液体积的3％，使用磁力搅拌器在50℃搅拌反应1小时后，加入为反应后所得物料2倍体积的4℃预冷的PBS，终止反应。将所得物料使用透析袋透析72h，温度40℃，透析袋截留分子量为3500Da，透析完成后，取出冻干，即得到甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)，-20℃保存备用。2、双基团明胶的制备：将步骤1所得甲基丙烯酸酐改性明胶重新溶解于50℃的PBS溶液中，GelMA与PBS缓冲液比例为0.1g：1mL；然后加入改性剂降冰片烯二酸酐，降冰片烯二酸酐质量占甲基丙烯酸酐改性明胶溶液质量的5％，搅拌条件下使用氢氧化钠溶液(1mol/L)调上述溶液pH至9，反应1h后，加入为反应后所得物料5倍体积的PBS终止反应，离心去除未溶解的杂质，透析72小时，冻干，即得到双基团光敏明胶，其核磁谱图如图1。利用上述制备的双基团光敏明胶构建三维培养体系：将上述制备的双基团明胶溶解于PBS中，双基团明胶：PBS＝0.1g：1mL，得到双基团本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双基团光敏明胶的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：/n(1)甲基丙烯酸酐改性明胶的制备：/n称取一定量的明胶加入PBS缓冲液中，加热至明胶完全溶解，得到明胶溶液；待明胶溶液降温至50℃，加入改性剂甲基丙烯酸酐，在50℃和搅拌条件下反应1小时；加入为反应液2倍体积的4℃预冷的PBS，终止反应；将所得溶液使用透析袋透析72h，透析温度40℃；透析完成后，取出冻干，获得所述甲基丙烯酸酐改性明胶；/n(2)双基团光敏明胶的制备：/n将步骤(1)所得甲基丙烯酸酐改性明胶重新溶解于50℃的PBS缓冲液中，得到甲基丙烯酸酐改性明胶溶液；然后加入改性剂降冰片烯二酸酐，搅拌条件下，使用氢氧化钠溶液调节溶液pH值至8-9，反应1h后，使用为反应液5倍体积的4℃预冷PBS终止反应；离心去除未溶解的杂质后，40℃条件下透析72小时，冻干，即得到所述双基团光敏明胶。/n

【技术特征摘要】
1.一种双基团光敏明胶的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)甲基丙烯酸酐改性明胶的制备：
称取一定量的明胶加入PBS缓冲液中，加热至明胶完全溶解，得到明胶溶液；待明胶溶液降温至50℃，加入改性剂甲基丙烯酸酐，在50℃和搅拌条件下反应1小时；加入为反应液2倍体积的4℃预冷的PBS，终止反应；将所得溶液使用透析袋透析72h，透析温度40℃；透析完成后，取出冻干，获得所述甲基丙烯酸酐改性明胶；
(2)双基团光敏明胶的制备：
将步骤(1)所得甲基丙烯酸酐改性明胶重新溶解于50℃的PBS缓冲液中，得到甲基丙烯酸酐改性明胶溶液；然后加入改性剂降冰片烯二酸酐，搅拌条件下，使用氢氧化钠溶液调节溶液pH值至8-9，反应1h后，使用为反应液5倍体积的4℃预冷PBS终止反应；离心去除未溶解的杂质后，40℃条件下透析72小时，冻干，即得到所述双基团光敏明胶。


2.根据权利要求1所述的双光敏基团明胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述明胶溶液中的明胶与PBS缓冲液的比例为0.1g：1mL；所加入的甲基丙烯酸酐的体积为明胶溶液体积的1-10％。


3.根据权利要求1所述的双光敏基团明胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述甲基丙烯酸酐改性明胶溶液中的甲基丙烯酸酐改性明胶与PBS缓冲液的比例为0.1g：1mL；所加入的降冰片烯二酸酐的质量为甲基丙烯酸酐改性明胶溶液质量的1-20％。


4.根据权利要求1所述的双光敏基团明胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，用于调节溶液pH值的氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L。


5.根据权利要求1所述的双光敏基团明胶的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑雄飞，郭凯，朱慧轩，李松，王赫然，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳自动化研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21