一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用，本发明专利技术公开的试纸条包括依次贴于底板上的样品垫、结合垫、分析膜和吸水滤纸，所述分析膜上设有检测线T和质控线C，所述检测线T包被如SEQ ID NO.1所示的NP抗原，所述质控线C包被抗IgG抗体，该试纸条可用于检测新冠病毒的抗体或者评价注射疫苗后的接种效果。

【技术实现步骤摘要】
一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种检测新型冠状病毒抗体的试纸条及其制备方法和应用。
技术介绍
新型冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2)，属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。目前，对于新型冠状病毒感染的常规检测方法主要为实时荧光RT-PCR，但是检测耗时长，试剂成本高，且由于多种原因可能会造成假阴性的检测结果，并且该检测方法对仪器和设备的要求较高，只适用于实验室检测，不适用于基层医疗机构以及现场的快速低成本检测。同时，多种其他的检测方法也都处在研究阶段。如酶联免疫分析，化学发光，时间分辨荧光等，但是上述检测手段均需要较为精密的实验仪器以及相当程度上对于实验人员操作经验的依赖。在最新的第七版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中新增血清新型冠状病毒特异性IgM抗体作为病原学诊断标准之一，IgM被普遍认为是感染病毒后人体内产生的第一道防线，对于IgM的快速准确检测时判断疾病急性期的重要依据和手段。尤其是对于此次爆发的COVID-19，存在大量的无症状感染者，这使得通过PCR等方法进行确诊的难度大幅度提高，所以开发研究针对新型冠状病毒IgM抗体的检测方法，不仅可以弥补核酸检测的不足，提高新型冠状病毒感染的诊断效率，又可以极大程度地避免确诊患者或疑似患者鼻咽拭子标本的采集和运输过程中给医务人员和其他相关工作人员带来的潜在风险。目前，免疫层析技术在众多领域得到了越来越大的重视，如食品安全、环境监测、药物筛选和医学检测等方面。虽然有很多较为成熟的，以荧光和电化学发光等为代表的特异性强，灵敏度高的定量或半定量的免疫检测方法，但是它们的缺点(操作复杂，检测过程耗时长)却不能被忽视。因此，急需一种新型的操作简单、耗时短、特异性强的快速检测技术(point-of-care,POCT)。本专利技术通过获得新型冠状病毒核蛋白(NP蛋白)，将抗原抗体的特异性结合特性与胶体金免疫层析技术相结合，采用间接法制备得到用于现场快速检测新型冠状病毒IgM抗体的胶体金免疫层析试纸条。整个检测过程无需复杂的操作技巧和精密的仪器设备，且成本低廉，运输方便，易于保存。因此，本专利技术的提出为新型冠状病毒IgM抗体的POCT快速诊断提供了一种高效实用的现场检测方法，对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的综合防控具有非常重要的实践意义以及广泛的应用前景。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种简单快速、特异性强且满足现场快速大规模筛查新型冠状病毒IgM抗体的间接法胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和相关应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面提供了一种检测SARS-CoV-2抗体的抗原，所述抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。进一步，所述抗原通过设计引物，以核酸阳性病例样本为模板，RT-PCR扩增N基因，并插入表达载体，导入大肠杆菌系统中进行可溶性表达，利用Ni亲和层析柱进行纯化表达得到。本专利技术的第二方面提供了一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2病毒的抗体的产品，所述产品包括本专利技术第一方面所述的抗原。进一步，所述产品包括试剂盒、检测卡或试纸条。进一步，所述试纸条为免疫层析试纸条。进一步，所述免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、分析膜、吸水滤纸和底板，其中结合垫上附着有标记物标记的SARS-CoV-2病毒抗体的特异性结合蛋白，所述分析膜上设有检测线T和质控线C，所述检测线T包被本专利技术第一方面所述的抗原；所述质控线C包被抗IgG抗体。进一步，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚酯纤维膜或无纺布。进一步，所述结合垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。进一步，制备胶体金的pH为7～10，作为本专利技术的一种优选的实施方式，PH为8。进一步，SARS-CoV-2病毒抗体的特异性结合蛋白为可与SARS-CoV-2病毒抗体IgM抗体结合的抗IgM抗体。进一步，抗IgM抗体为鼠抗人IgM。进一步，所述抗IgM抗体为不同的抗IgM抗体的混合抗体。在本专利技术的具体实施方式中，鼠抗人IgM为两种不同规格和浓度的鼠抗人IgM。进一步，不同的抗IgM抗体的混合比例为1:1(质量比)。进一步，每200μL胶体金的鼠抗人IgM的标记量为0.75μg～7.5μg，作为本专利技术的一种优选的实施方式，每200μL胶体金的鼠抗人IgM的标记量为1.8μg。进一步，所述分析膜为硝酸纤维素膜；所述底板为PVC底板。进一步，质控线C为羊抗鼠IgG。进一步，质控线C的包被浓度为1.0mg/mL～2.0mg/mL，作为本专利技术的一种优选的实施方式，质控线C的包被浓度为2.0mg/mL。进一步，检测线T的抗原包被浓度为0.6～1.2mg/mL，作为本专利技术的一种优选的实施方式，抗原包被浓度为1.2mg/mL。使用本专利技术所述的的胶体金免疫层析试纸条用于新型冠状病毒IgM抗体检测时按照以下步骤进行：用移液枪或者一次性滴管吸取待测血清样本20μL于检测卡上样本孔内，立即在样本孔内滴加2-3滴(约70-100μL)样本稀释液，并保证过程中没有气泡产生，10分钟后判读结果。结果判定：阴性结果：仅出现质控线C，检测线T不显色，说明没有检测到新型冠状病毒IgM抗体，结果为新型冠状病毒IgM抗体阴性。阳性结果：质控线C和检测线T都出现，说明检测到新型冠状病毒IgM抗体，结果为新型冠状病毒IgM抗体阳性。无效结果：质控线C未出现，无论检测线T是否出现，均为无效结果。本专利技术的第三方面提供了一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2病毒的抗体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：(1)制备免疫金体胶结合垫用氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液制备胶体金溶液，碳酸钾调节胶体金溶液的pH，依次加入待标记的特异性结合蛋白、BSA溶液，离心得到沉淀，金体胶复溶液重悬沉淀得到免疫金胶复合物溶液，将溶液滴涂经结合垫处理液处理的集合垫上；(2)制备分析膜用包被缓冲液稀释本专利技术第一方面所述的抗原划线得到检测线T，用包被缓冲液稀释抗IgG抗体划线作为质控线C，使用BSA的磷酸盐缓冲液封闭；(3)试纸条的组装在黏性底板上依次黏贴样品垫、结合垫、分析膜和吸水纸，裁剪成合适的宽度的试纸条。进一步，步骤(1)中的pH为7～10，作为本专利技术的一种优选的实施方式，PH为8。进一步，特异性结合蛋白为抗IgM抗体，在本专利技术的具体实施方式中，所述抗IgM抗体为鼠抗人IgM抗体。进一步，每200μL胶体金的鼠抗人IgM的标记量为0.75μg～7.5μg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测SARS-CoV-2抗体的抗原，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测SARS-CoV-2抗体的抗原，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。


2.一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2病毒的抗体的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的抗原，优选的所述产品包括试剂盒、检测卡或试纸条，优选的，所述试纸条为免疫层析试纸条。


3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、分析膜、吸水滤纸和底板，其中结合垫上附着有标记物标记的SARS-CoV-2病毒抗体的特异性结合蛋白，所述分析膜上设有检测线T和质控线C，所述检测线T包被权利要求1所述的抗原；质控线C包被抗IgG抗体；
优选的，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚酯纤维膜或无纺布；
优选的，所述结合垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；
优选的，所述标记物为胶体金，优选的，所述胶体金纳米颗粒直径为30nm；
优选的，制备胶体金的pH为7～10，优选的，PH为8；
优选的，SARS-CoV-2病毒抗体的特异性结合蛋白为抗IgM抗体，优选的，为鼠抗人IgM，优选的，标记量为0.75μg～7.5μg；优选的标记量为1.8μg；
优选的，分析膜为硝酸纤维素膜；所述底板为PVC底板；
优选的，质控线C为羊抗鼠IgG，优选的，质控线C的包被浓度为1.0mg/mL～2.0mg/mL，优选的为2.0mg/mL；
优选的，检测线T的抗原包被浓度为0.6～1.2mg/ml，优选的为1.2mg/mL。


4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述抗IgM抗体为不同的抗IgM抗体的混合抗体，优选的，混合比例为1:1。


5.一种检测SARS-CoV-2病毒感染/抗SARS-CoV-2病毒的抗体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备免疫金体胶结合垫
用氯化金溶液和柠檬酸三钠溶液制备胶体金溶液，碳酸钾调节胶体金溶液的pH，依次加入待标记的特异性结合蛋白、BSA溶液，离心得到沉淀，金体胶复溶液重悬沉淀得到免疫金胶复合物溶液，将溶液滴涂经结合垫处理液处理的集合垫上；
(2)制备分析膜
用包被缓冲液稀释权利要求1所述的抗原划线得到检测线T，用包被缓冲液稀释抗IgG抗体划线作为质控线C，使用BSA的磷酸盐缓冲液封闭；
(3)试纸条的组装
在黏性底板上依次黏贴样品垫、结合垫、分析膜和吸水纸，裁剪成合适的宽度的试纸条。


6.根据权利要求5所述的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄超，温恬，焦永军，曾晓燕，史凤娟，朱宝立，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心江苏省公共卫生研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32