一种检测恩诺沙星的ELISA试剂盒的制备制造技术

一种检测恩诺沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法，所述的试剂盒由带有微孔的包被板，恩诺沙星标准品，抗恩诺沙星的包被抗体，恩诺沙星酶标抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成；取包被抗恩诺沙星抗原的微孔包被板，加入恩诺沙星标准品或处理好的样品到各自的微孔中，同时加入恩诺沙星抗体工作液，再加入恩诺沙星酶，震荡反应，洗涤液洗涤，经底物显色，样本吸光值与其含有的恩诺沙星量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中恩诺沙星的含量。

Preparation of an ELISA kit for detection of Enrofloxacin

【技术实现步骤摘要】
一种检测恩诺沙星的ELISA试剂盒的制备
一种快速高效检测食品中抗生素恩诺沙星的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA)
，主要用于食品中恩诺沙星残留的检测。
技术介绍
恩诺沙星是氟喹诺酮类抗生素，具有下列特性：由于独特的化学结构，使其成为兽医临床药物中十分重要的抗生素。恩诺沙星对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和支原体类病原菌均具有广谱抗菌活性，在一定的浓度下对细菌支原体也具有杀菌作用，还能杀死对抗生素具有抗药力的细菌，例如抗p一乳酸菌素、氨基糖昔等。恩诺沙星因其具有独特的作用，自80年代开始就被广泛的应用于动物和鱼虾类的疾病的预防和治疗。但最近的研究发现，凡使用过恩诺沙星的动物，在一定时期内其产品都有残留，因其具有神经毒性和肾脏毒性，所以在动物食品中残留会对人类健康造成威胁和影响，欧美国家及我国均要求对其限量使用。2002年12月我国农业部公告第235号文规定在所有食品动物的肌肉、脂肪中最高残留限量为100μg/kg，在所有食品动物的肝、肾中最高残留限量为200μg/kg。因此，恩诺沙星己经列为兽药残留监控的重点。检测恩诺沙星残留量的化学方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气一质联机(GC/MS)、液一质联机(HPLC/MS)、毛细管电泳(CE)等，由于复杂的仪器设各和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。免疫分析技术以其抗原抗体反应的高度专一性，以及测定方法简单、快速、灵敏度高、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点，在农兽药残留分析中展示了广泛的应用前景。随着农药残留免疫学检测技术不断被完善和商品化，免疫学检测技术会成为食品农兽药残留和食品安全质量控制的有效快速检测手段。基于目前兽药残留诊断试剂的研究现状，及时开发出优于目前的、快速灵敏的检测试剂可谓是当务之急。虽然农兽药残留分析的方法虽然有很多，但是利用免疫学技术进行分析是特异性最好、检测时间最短的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效快速检测恩诺沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法，主要用于食品检测行业中恩诺沙星含量的检测。本专利技术的技术方案是：该检测恩诺沙星的试剂盒是由96微孔的包被板，恩诺沙星标准品，抗恩诺沙星的包被抗体，酶标记的恩诺沙星抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成；所述的包被板配置有采用1％明胶作为封闭液，抗体的稀释液选用0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。所述恩诺沙星半抗原是将恩诺沙星和8-氨基辛酸通过酞化方一法得到的。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酷酶，其中优选碱性磷酸酷酶；碱性磷酸酷酶标记的恩诺沙星半抗原可将碱性磷酸酷酶与恩诺沙星半抗原通过戊二醛法或过碘酸钠法将酶交联在恩诺沙星半抗原上。单克隆抗体的制备动物免疫：采用BABL/C小鼠作为免疫动物，免疫原是恩诺沙星-BSA，免疫剂量是50-100μg/只，第一次用免疫原与等量弗氏完全佐剂混合乳化，腹腔注射，剂量为100μg/0.2mL/只；3周后用兔疫原与等量弗氏不完全佐剂混合乳化进行第二次免疫注射，剂量为50μg/0.2mL/只，间隔2周后，以不完全佐剂乳化的抗原进行第三次免疫注射，剂量为50μg/0.2mL/只。筛选动物免疫血清：以上免疫小鼠在第三次免疫后7-10天后用ELISA法测血清效价，同时利用间接竞争ELISA法检测血清对恩诺沙星的抑制效果。选取血清效价高的小鼠进行加强免疫，免疫三天后取脾脏。制备杂交瘤细胞：取上述免疫BABL/C小鼠的脾细胞，以50%的PEG4000作融合剂，将免疫肿细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1的比例进行细胞融合。采用间接ELISA检测细胞上清，筛选出阳性克隆，对阳性克隆进一步用间接竞争ELISA法检测，仍为阳性者利用有限稀释法进行亚克隆，经3次亚克隆以后，检测有单克隆生长孔的细胞培养上清，阳性率达到100%，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的恩诺沙星标准品，是从干粉中稀释得到，稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，恩诺沙星浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL，8.1ng/mL。所述的抗恩诺沙星包被抗体为多克隆抗体，它们均是用恩诺沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述的恩诺沙星半抗原是将恩诺沙星和EDC法作用得到的；所述的载体蛋白为匙孔蓝蛋白。本专利技术优选的检测恩诺沙星的方法是：取包被有恩诺沙星抗原的微孔包被板，加入50μL恩诺沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50μL恩诺沙星抗体，震荡混匀，25℃反应30min左右，洗涤液洗涤五次，然后再加入150μL酶，25℃反应30min,洗涤液洗涤5次加50μL显色液A和50ul显色液B，25℃孵育15分钟后加终止液，在450nm/630nm处测量吸光值(OD值)，对照标准曲线计算样品中的恩诺沙星含量。本专利技术所述的样品处理是根据猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋这些样品选择优化的前处理方法，包括：样品切碎、研磨后各称取5g样本于50mL离心管中，再加入乙腈10mL，充分振荡混匀5分钟，4500转离心5分钟。取上清液2mL于15mL离心管中50℃氮气吹干。加1mL正己烷，振荡10秒，再加入2mLPBS，振荡2分钟，4500转离心5分钟，去除上层有机相，取1.5mL左右下层液于离心管中备用。本专利技术的有益效果：该试剂盒结构简单，组成成分少、使用方便、廉价、灵敏度高。酶联免疫检测试剂盒的结果分析：标准曲线绘制，以标准品浓度自然对数为X轴，吸光值为Y轴制作而成的曲线图。分别对0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL，8.1ng/mL的标准品进行检测，每个浓度做3个平行，取平均值，以标准品浓度自然对数为X轴，吸光值为Y轴，做标准曲线，计算其变异系数。附图说明图1为恩诺沙星标准曲线。具体实施方式本专利技术所述的检测恩诺沙星的试剂盒，它是由96微孔的包被板，恩诺沙星标准品，抗恩诺沙星的包被抗体，酶标记的恩诺沙星抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成。试剂的配制：（1）恩诺沙星标准品：(0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL，8.1ng/mL)从恩诺沙星高标中稀释得到，稀释液为甲醇:水体积比为4:6。（2）洗涤液：14.5mmol/LNaCl、0.2ml/LTween-80和0.2%NaN3的50mmo1/LTris-HClpH7.8。（3）显色液A：0.2MNa2HPO425.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL和30%的H2O25本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测恩诺沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于：它由带有微孔的包被板，恩诺沙星标准品，抗恩诺沙星的包被抗原，恩诺沙星酶标抗体，浓缩洗涤液，显色液 A，显色液 B和终止液组成；所述的包被板配置有采用 1％明胶作为封闭液，抗体的稀释液选用0.15mol/L 的磷酸盐缓冲溶液，所述的浓缩洗涤液为含有 0.07％～ 0.1％吐温的 Tris-HCL缓冲溶液，显色液 A 为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液 B 为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，所述的终止液为 2mol/L 的硫酸溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测恩诺沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于：它由带有微孔的包被板，恩诺沙星标准品，抗恩诺沙星的包被抗原，恩诺沙星酶标抗体，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成；所述的包被板配置有采用1％明胶作为封闭液，抗体的稀释液选用0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。


2.根据权利要求1所述的检测恩诺沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的恩诺沙星标准品，是从干粉中稀释得到，稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，恩诺沙星浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL，8.1ng/mL。


3.一种检测恩诺沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于：取包被有恩诺沙星抗原的微孔包被板，加入50μL恩诺沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50μL恩诺沙星抗体，震荡混匀，25℃反应30min左右，洗涤液洗涤五次，然后再加入150μL酶，25℃反应30min,洗涤液洗涤5次加...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪霞，杜霞，
申请(专利权)人：江苏维赛科技生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32