异源生产线性三萜的方法技术

一种采用合成生物学手段发现和异源生产线性三萜的方法，在酿酒酵母细胞异源表达灵芝来源的cyp505d13基因，并对酵母工程菌株的发酵产物进行分离纯化、质谱和核磁共振等分析，确定产生了线性三萜类化合物1、化合物2和化合物3，其中化合物1和2从未见报道。本发明专利技术包含从cyp505d13基因的发现，到产物生产鉴定，最终获得异源生物合成的线性三萜类物质等一系列的设计及验证，也为异源生产其它线性三萜类活性物质提供了范例。

Heterologous production of linear triterpenes

【技术实现步骤摘要】
异源生产线性三萜的方法
本专利技术涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种生物合成线性三萜类化合物的方法。
技术介绍
三萜类化合物是分布最广的天然产物，是一类结构多样，成员数目近20000个的C30化合物(Sumit,2016)。根据其结构差异，三萜类化合物可分为线性三萜(角鲨烯型)和环状三萜(如羊毛甾烷型、油烷型、熊烷型、芦丁烷型)。三萜类化合物具有许多有前途的生物活性，包括抗癌、抗氧化、抗炎等(Malwina,2015)。其中许多线性三萜，因含有多个非共轭双键，具有较强抗氧化活性(Farvink,2007)。在提高体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体免疫力、药物递送和皮肤护理方面都有特别重要的作用(Bindubscm,2015)。因此，高效生产线性三萜引发了学术界和产业界的广泛关注。线性三萜的前体角鲨烯可通过甲戊酸钠(MVA)(Chappell,1995)或甲基赤藓醇4-磷酸(MEP)(Rohmer,1999)途径产生。角鲨烯形成后，经过一系列后修饰，最终产生结构功能多样的线性三萜，这些后修饰主要由细胞色素P450(CytochromeP450,CYP)催化完成(Steven,2013)。由于参与线性三萜生物合成的CYP发现和相关研究非常有限，这极大阻碍了它们的高效生产和广泛应用。蘑菇类真菌含有丰富多样的CYP，并且可以产生多种独特的三萜类化合物，在生态系统和人类营养与健康中发挥着重要作用(ChenW,2014)。然而，由于基因操作的不成熟，其CYP的功能鉴定相对植物和原核生物的相关研究滞后(HaoQ,2017)。为了克服这一局限，我们以酿酒酵母作为筛选宿主，用于筛选参与线性三萜生物合成的关键CYP。选择酿酒酵母的其原因是：(1)酿酒酵母遗传操作简单，背景清楚(Joshua,2018)；(2)它能天然产生线性三萜类化合物的直接前体——角鲨烯(GenlinZhang,2015)；(3)它具有支持膜蛋白CYP功能的亚细胞器(如内质网)；(4)很少有内源性CYP对外源CYP产生干扰。
技术实现思路
本专利技术提出一种生物合成线性三萜类化合物的方法，通过筛选线性三萜生物合成相关的CYP基因，并在酿酒酵母细胞异源表达，从而实现异源合成线性三萜。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术涉及一类线性三萜类化合物，其分子式及结构式包括：化合物1：化合物2：化合物3：本专利技术涉及一种灵芝线性三萜合成基因，即cyp505d13，其核苷酸序列如SeqNo.1所示，氨基酸序列如SeqNo.2所示。cyp505d13编码的蛋白质CYP505D13属于CYP505家族，目前已报道的CYP505家族的成员催化的底物最长碳链仅为C20(Baker,G.J.,Girvan,H.M.,Matthews,S.,McLean,K.J.,etal.,Expression,Purification,andBiochemicalCharacterizationoftheFlavocytochromeP450CYP505A30fromMyceliophthorathermophila.ACSomega2017,2,4705-4724；Nakayama,N.,Takemae,A.,Shoun,H.,CytochromeP450foxy,acatalyticallyself-sufficientfattyacidhydroxylaseofthefungusFusariumoxysporum.Journalofbiochemistry1996,119,435-440；Kitazume,T.,Tanaka,A.,Takaya,N.,Nakamura,A.,etal.,KineticanalysisofhydroxylationofsaturatedfattyacidsbyrecombinantP450foxyproducedbyanEscherichiacoliexpressionsystem.Europeanjournalofbiochemistry2002,269,2075-2082.)，CYP505D13是首个发现与催化C30相关的CYP05家族成员，也是首个发现的后修饰线性三萜(C30)的CYP。本专利技术涉及上述线性三萜类化合物的异源合成方法，通过将cyp505d13基因克隆到酵母表达质粒，并将酵母表达质粒转化至重组酿酒酵母中进行异源表达，从而实现线性三萜的异源生物合成。所述的异源表达具体是指：通过PCR扩增cyp505d13基因的表达序列片段，以同源重组的方法将表达载体pRS426、所述表达序列片段、酵母HXT7p启动子和酵母FBA1t终止子重组连接，得到重组表达质粒，重组酵母可进行线性三萜的生产。所述的转化，通过标准的醋酸锂转化法(Gietzetal.,1991)进行发酵筛选，具体为：将表达质粒导入酿酒酵母，通过YPD培养基发酵，发酵产物经乙酸乙酯振荡萃取，随后减压蒸馏除去乙酸乙酯，剩余物用甲醇溶解，最后通过HPLC分析观察。所述的YPD培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。所述的重组酿酒酵母为基因工程改造后的BY4742菌株YL-T3(BY4742,Δtrp1,δDNA::PPGK1-tHMG1-TADH1-PTEF1-LYS2-TCYC1,TRP::HIS-PPGK1-ERG20-TADH1-PTEF1-ERG9-TCYC1-PTDH3-ERG1-TTPL1)，BY4742菌株为本领域技术人员常用的一种商品化酵母宿主。在此基础上过表达了角鲨烯生物合成途径上游的tHMG1基因、ERG20基因、ERG9基因和ERG1基因，从而提高了线性三萜前体的合成量，其构建采用(Wangetal.,BiotechnolBioeng,2018,115(7):1842-1854)文献中的方法实现。技术效果与现有技术相比，本专利技术通过从灵芝基因组中挖掘到一个参与线性三萜合成的cyp505d13基因(gl17184)，利用合成生物学技术构建了酵母工程菌株，实现线性三萜类物质的异源生物合成。该技术为继续发现与线性三萜生物合成相关的关键酶和化合物，以及有效生物合成该类物质奠定了基础。附图说明图1为本专利技术表达载体pRS426-HXT7p-cyp505d13-FBA1t示意图；图2为酵母转化菌株和对照菌株发酵第4天产物UPLC分析图；图中：A图蓝线为YL-T3-cyp505d13发酵第四天产物UPLC结果；黑线为对照YL-T3-Voidplasmid第四天产物UPLC结果。B、C、D为cyp505d13导入后，三个典型的新产物MS图，分别为化合物1、化合物2、化合物3。图3为表达cyp505d13的酵母转化株生长曲线及三种产物产量图。图中：A为生长曲线图；实线为YL-T3-cyp505d13，虚线为YL-T3-Voidplasmid。B为产物(化合物1、化合物2、化合物3)积累图。三角形为化合物1，圆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一类线性三萜类化合物，其特征在于，包括以下分子式及结构式：/n①C

【技术特征摘要】
1.一类线性三萜类化合物，其特征在于，包括以下分子式及结构式：
①C30H50O3



②C30H50O3



③C30H50O2





2.一种灵芝线性三萜合成基因cyp505d13，其特征在于，其核苷酸序列如SeqNo.1所示，氨基酸序列如SeqNo.2所示。


3.一种线性三萜类化合物的异源合成方法，其特征在于，通过将权利要求2所述的cyp505d13基因克隆到酵母表达质粒，并将酵母表达质粒转化至重组酿酒酵母中进行异源表达，从而实现线性三萜的异源生物合成。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的异源表达具体是指：通过PCR扩增cyp505d13基因的表达序列片段以同源重组的方法将表达载体pRS426、所述表达序列片段、酵母HXT7p启动子和酵母FBA1t终止子重组连接，得到重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖晗，沈瑛，宋欣，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31