旱莲草内生细菌、旱莲草组合物及其应用制造技术

本申请涉及旱莲草内生细菌及其组合物，它们的抑菌用途，本申请还涉及旱莲草组合物在调节受试者肠道菌群中的用途及方法。

Endophytic bacteria and composition of Eclipta prostrata and their application

【技术实现步骤摘要】
旱莲草内生细菌、旱莲草组合物及其应用
本申请涉及旱莲草内生细菌及其组合物，以及它们的抑菌用途，本申请还涉及旱莲草组合物在调节受试者肠道菌群中的用途及方法。
技术介绍
近年来，中医药对肠道菌群的调控越来越受到重视[1-3]。理论研究和实验研究都证实了一些单一的中药或化合物可以调节肠道微生态平衡[4,5]。一些中药可以直接抑制有害细菌，同时间接增加肠道菌群中有益细菌的丰度，从而产生抗菌化合物[6]。此外，中药促进的肠道微生物或植物性中药内生菌也可能产生抗菌药物，抑制病原微生物的生长，调节肠道菌群失调[7,8]。最近的研究表明，中医药在适当的临床剂量下，通过促进保加利亚乳杆菌的生长，在增加益生菌数量的同时减少致病菌数量，抑制致病菌金黄色葡萄球菌，优化肠道菌群结构，发挥其有益作用[9]。内生细菌及其代谢产物在农业、食品、医药、生态等领域发挥着重要作用[11,12]。近年来，植物内生菌的研究取得了一些进展，发现了许多药用菌株和化合物[10,13,14]。内生细菌具有广泛的抗菌活性，是抗菌物质的重要潜在来源[15]。植物内生细菌的抗菌物质具有较低的细胞毒性，大多是新奇的[16]。此外，内生菌可以调节植物次生代谢产物的生物合成[17]。中药植物内生微生物多为真菌，如shelby等在高羊茅内生真菌中发现的麦角生物碱等[18]。Salituro等人从热带植物内生真菌假黑壳次生代谢神中获得小分子苯醌，作用类似胰岛素[19]；Yang等从西藏红豆杉内生真菌中提取具有抗菌活性的萘醌[20]；Wang等人从银杏叶中分离出一株内生次生孢子壳菌，并产生具有抗氧化活性的黄酮类化合物[21]。植物内生细菌也有报道，但中医药报道较少。内生细菌，包括芽孢杆菌、肠杆菌和节杆菌，普遍存在于植物的根和茎中[10]。植物内生细菌大多来源于根际，与土壤中的普通细菌相同[22]。产生抗生素或促进植物生长的生物量在生物控制、固氮和植物生长方面发挥着重要作用[23]。然而，从中草药或植物中筛选内生细菌，以及它们如何与植物相互作用以发挥其生物学功能仍有待研究。药用植物内生细菌能够经口进入肠道，影响肠道微生态平衡。因此，植物内生细菌的研究和应用具有广阔的前景。旱莲草(Ecliptaprostrata)(名称来源于全球菊科植物名录http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/gcc-6746)是向日葵科的一种植物，在传统医案中被用于治疗子宫出血、牙齿松动、耳鸣和头晕[24]。我们先前的临床试验发现，含有旱莲草的配方有效地治疗了围绝经期症状[25]。药理研究表明，旱莲草具有保肝、止血、抗肿瘤、抗炎、抗高血压、降血糖和抗骨质疏松的作用[26-33]。现代中医学研究表明，中药的药效学与其所含化合物的种类和数量有关[17]。旱莲草含有多种活性成分，包括三萜、黄酮、噻吩[34-37]。有些是非微生物诱导和在草药中预先形成的抗菌物质；有些不是由草药本身产生的，而是由内生微生物产生的。鉴于中药基于肠道菌群的药效作用，从中药中筛选和分析内生细菌是药效学研究的热点领域，具有重要的研究意义和应用前景。
技术实现思路
本研究从旱莲草野生植物中分离到多种内生细菌，其中EP01对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有明显的抑制作用。通过全基因组测序，对该细菌进行进一步鉴定，并对基因组中抗菌物质生物合成基因簇进行预测。最后通过动物实验验证了旱莲草提取物对肠道菌群的作用来自其内生细菌。本专利技术的一个目的是提供一种旱莲草内生细菌：旱莲草内生细菌EP01，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且具有保藏号CGMCCNo.19512，保藏日期：2020年3月26日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述保藏的旱莲草内生细菌EP01的建议分类命名为：格氏乳球菌Lactococcusgarvieae。本专利技术的另一个目的是提供一种组合物，其含有上述内生细菌EP01。在一些实施方案中，所述组合物为粉末或液体；优选地，所述组合物通过以下方式施用：口服使用、用于栓剂进行施用、用于皮下注射、用于静脉注射，或者作为用于吸入的液体。本专利技术的第三个目的是提供上述的组合物在抑制细菌生长中的用途；所述细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，所述革兰氏阳性细菌包括但不限于：葡萄球菌属、链球菌属、梭菌属、放线菌属、奴卡菌属、红球菌属、棒状杆菌属、分支杆菌属、李氏杆菌属、肾杆菌属、炭疽杆菌属、破伤风杆菌属、抗酸菌属。在一些实施方案中，所述革兰氏阴性细菌包括但不限于：淋球菌属、脑膜炎双球菌属、卡他菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌属、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌属、副溶血性杆菌属、大肠杆菌属、沙门菌属、假单胞菌属、变形杆菌属、布氏杆菌属。在一些优选的实施方案中，所述细菌为金黄色葡球菌和大肠杆菌。本专利技术的第四个目的是提供旱莲草提取物在制备药物中的用途，所述药物用于调节受试者肠道微生物或治疗与肠道菌群紊乱相关疾病。在一些实施方案中，所述旱莲草提取物是通过以下方法制备的：称取一定量旱莲草，经乙醇回流提取，优选70％乙醇回流提取，更优选8倍量70％乙醇回流提取两次，每次1.5h；合并滤液后，干燥得旱莲草提取物。在一些实施方案中，所述旱莲草提取物调节受试者肠道微生物是通过增加肠道中细菌的数量，所述细菌选自：芽孢杆菌属，乳酸杆菌属，嗜臭菌属，乳球菌属，奇异菌属，普氏菌UCG-004属，或其任何组合。在另一些实施方案中，所述旱莲草提取物调节受试者肠道微生物是通过抑制肠道中细菌的数量，所述细菌选自：瘤胃菌属9，厌氧棍状菌属，瘤胃菌属，普氏菌UCG-001属，不动杆菌，拟杆菌，副拟杆菌，或其任何组合。在某些实施方案中，所述受试者是指哺乳动物，包括但不限于，人，啮齿类动物(小鼠，大鼠，豚鼠)，狗，马，牛，猫，猪，猴，黑猩猩。在某些优选的实施方案中，所述受试者是人。术语解释如本文中所使用的，术语“16SrDNA序列”是指，编码16SrRNA的DNA序列，其存在于所有细菌基因组中，一般由保守区和可变区组成。保守区在细菌间无显著差异，可用于构建所有生命的统一进化树。可变区在不同细菌中存在一定差异，对16SrDNA可变区进行测序，可对细菌菌群进行精细鉴定至种的级别。如本文中所使用的，术语“有效剂量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。专利技术的有益效果本申请从旱莲草中分离到多株内生细菌，其中分离到的EP01对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有明显的抑制作用，证实旱莲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种旱莲草内生细菌EP01，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且具有保藏号CGMCC No.19512。/n

【技术特征摘要】
1.一种旱莲草内生细菌EP01，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且具有保藏号CGMCCNo.19512。


2.一种组合物，其含有权利要求1所述的内生菌。


3.权利要求2所述的组合物，所述组合物为粉末或液体；优选地，所述组合物通过以下方式施用：口服使用、用于栓剂进行施用、用于皮下注射、用于静脉注射，或者作为用于吸入的液体。


4.权利要求2或3所述的组合物在抑制细菌生长中的用途，其中所述细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌；
优选地，所述革兰氏阳性细菌包括但不限于：葡萄球菌属、链球菌属、梭菌属、放线菌属、奴卡菌属、红球菌属、棒状杆菌属、分支杆菌属、李氏杆菌属、肾杆菌属、炭疽杆菌属、破伤风杆菌属、抗酸菌属；
优选地，所述革兰氏阴性细菌包括但不限于：淋球菌属、脑膜炎双球菌属、卡他菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌属、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌属、副溶血性杆菌属、大肠杆菌属、沙门菌属、假单胞菌属、变形杆菌属、布氏杆菌属；
更优选地，所述细菌为金黄色葡球菌和大肠杆菌。

【专利技术属性】
技术研发人员：赵鑫，高秀梅，刘二伟，王亚静，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：天津;12