靶向非病毒DNA插入制造技术

本文提供了用于编辑细胞基因组的方法和组合物。在一些实施方式中，将长度为至少200个核苷酸的核苷酸序列插入细胞基因组中的靶区域。

Target non viral DNA insertion

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向非病毒DNA插入在先相关申请本申请要求2017年6月15日提交的美国临时申请号62/520,117和2017年8月30日提交的美国临时申请号62/552,180的权益，其各自通过引用全文纳入本文。联邦资助的研究与开发下作出专利技术的权利声明本专利技术是在政府支持下由国家卫生研究院授予的基金号P50GM082250资助完成。政府对本专利技术拥有一定的权利。
技术介绍
已经开发了通过将Cas9-gRNA复合物(RNP)电穿孔到细胞中在细胞基因组中靶向的位点处导入小突变(插入缺失)的能力。然而，因为这些突变是随机的并且通过非同源的末端连接导入，它们可以导致蛋白质被从框架中敲除(Schumann等PNAS112(33):10437-10442(2015))。已经开发了其他方法，通过使化学合成产生的小ssDNA寡核苷酸(ssODN)电穿孔，在基因组中指定的靶位点处导入定义的DNA序列。这允许经由同源介导的修复(称为HDR)整合非常少量的外源性DNA(通常为约1碱基对(bp)-约30碱基对(bp))，其比NHEJ效率低，但是允许确定最终序列。然而，因为这些寡核苷酸的大小受到可以化学合成的DNA的长度(＜约200bp)的限制，并且其中很大一部分被同源臂吸收，由于整合的限定大小，许多应用不可以采用该方法。除了大小限制，已确定的是由于固有细胞保护机制的激活，将裸DNA，特别是大于约200bp的裸DNA电穿孔到细胞中常常导致大量细胞死亡(Cornu等Nat.Med.23:415-423(2017)；Hornung和Latz,NatureReviewsImmunology10:123-130(2010)；Zhao等,Mol.Ther.13(1):151-159(2006))。虽然已经将非整合性病毒载体，诸如整合酶缺陷型慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体用于递送大供体核酸序列至细胞，但是这些载体需要病毒感染并导致脱靶效应。因此，需要用于将大核苷酸序列靶向插入细胞基因组中的方法和组合物。专利技术概述本专利技术涉及用于编辑细胞基因组的组合物和方法。专利技术人已经发现，可以将大核苷酸序列，例如，长度大于约200个核苷酸的序列，插入细胞基因组中靶向的区域。在一些方法中，整合长度大于约200个核苷酸的序列发生时降低脱靶效应和/或减少细胞活力的损失。在一些实施方式中，本专利技术提供了编辑细胞基因组的方法，该方法包括：a)提供Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)-DNA模板复合物，其包含：(i)RNP，其中RNP包含Cas9核酸酶结构域和向导RNA，其中向导RNA与细胞基因组的靶区域特异性地杂交，并且其中Cas9核酸酶结构域切割靶区域以在细胞基因组中产生插入位点；和(ii)双链或单链DNA模板，其中DNA模板的大小大于约200个核苷酸，其中DNA模板的5′和3′末端包含与侧接插入位点的基因组序列具有同源性的核苷酸序列，并且其中复合物中RNP与DNA模板的摩尔比为约3:1-约100:1；和b)将RNP-DNA模板复合物导入细胞。在一些实施方式中，DNA模板是线性DNA模板。在一些示例中，DNA模板是单链DNA模板。在一些实施方式中，单链DNA模板是纯单链DNA模板。在一些实施方式中，通过用DNA模板与RNP在约20°-25℃的温度孵育约1-30分钟形成RNP-DNA模板复合物。在一些实施方式中，在将RNP-DNA模板复合物导入细胞之前混合RNP-DNA模板复合物和细胞。在一些实施方式中，RNP包含Cas9核酸酶。在一些实施方式中，RNP包含Cas9切口酶。在一些实施方式中，RNP-DNA模板复合物包含至少2种结构不同的RNP复合物。在一些实施方式中，至少两种结构不同的RNP复合物包含结构不同的Cas9核酸酶结构域。在一些实施方式中，至少两种结构不同的RNP复合物包含结构不同的向导RNA。在一些实施方式中，其中至少两种结构不同的RNP复合物包含结构不同的向导RNA，结构不同的RNA复合物各自包含Cas9切口酶，并且结构不同的向导RNA杂交靶区域的相对链。在一些实施方式中，将RNP-DNA模板复合物导入细胞包括电穿孔。在一些实施方式中，RNP与DNA模板的摩尔比为约5:1至约15:1。在一些实施方式中，RNP与DNA模板的摩尔比为约5:1至约10:1。在一些实施方式中，RNP与DNA模板的摩尔比为约8:1至约12:1。在一些实施方式中，DNA模板的浓度为约2.5pM至约25pM。在一些实施方式中，DNA模板的大小大于约1kb。在一些实施方式中，DNA模板的量为约1μg至约10μg。在一些实施方式中，将RNP-DNA模板复合物导入约1x105至约2x106个细胞。在一些实施方式中，细胞是原代造血细胞或原代造血干细胞。在一些实施方式中，原代造血细胞是免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，T细胞是调节T细胞、效应T细胞或原初T细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD4+CD8+T细胞。附图说明本申请包括下述附图。这些附图用于说明组合物和方法的某些实施方式和/或特征，并对组合物和方法的描述构成补充。附图并不旨在限制组合物和方法的范围，除非书面说明明确地表明是这类情况。图1显示了电穿孔高浓度裸DNA以实现细胞中可行编辑效率后的低细胞活力。图2显示了电穿孔时在添加细胞前通过短暂室温孵育使用RNP复合DNA模板(质粒)降低了电穿孔一定量长质粒dsDNA后通常可见的活力损失。图3显示了电穿孔时在添加细胞前通过短暂室温孵育使用RNP复合DNA模板(线性，双链DNA(dsDNA)模板)降低了电穿孔长线性双链DNA后通常可见的活力损失。图4显示了RNP与DNA模板约10：1的示例性摩尔比在电穿孔后保持整合效率以及活力。图5显示了RNP与DNA模板约10：1的示例性摩尔比平衡活力损失和效率的效果，并使整合阳性细胞的数量最大化。图6显示了RNP与DNA模板约10：1的示例性摩尔比允许高效率插入大小大于750碱基对的大模板。图7显示了长DNA模板的插入可以仍然导致一定量的脱靶整合。图8显示了可以通过使用长单链DNA(ssDNA)模板作为供体来减少脱靶整合。图9显示了本文所公开的非病毒整合可以使用两种gRNA和Cas9切口酶(D10A)插入，这防止了脱靶dsDNA断裂。图10A-F显示了CRISPR/Cas9RNP共同电穿孔减少了dsDNA诱导的活力损失。(A)经电穿孔进入原代人T细胞的线性dsDNA模板(同源介导的修复模板，约1350bp长，靶向GFP融合体至RAB11A，图11A)随着模板量的增加而导致显著的活力损失。电穿孔相同量的dsDNA模板以及100pmol的RNP令人惊讶地增加活力。(B)对于质粒和线性dsDNA模板，RNP的添加增加电穿孔后的活力。值得注意的是，并未在短ssDNA寡聚供体核苷酸(ssODN)观测到活力损失。(C)RNP必须与DNA同时递送以观测到活力增加。对来自两个供体的T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编辑细胞基因组的方法，所述方法包括：/na)提供Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)-DNA模板复合物，其包含：/n(i)所述RNP，其中所述RNP包含Cas9核酸酶结构域和向导RNA，其中所述向导RNA与所述细胞基因组的靶区域特异性地杂交，并且其中所述Cas9核酸酶结构域切割所述靶区域以在所述细胞的基因组中产生插入位点；和/n(ii)双链或单链DNA模板，其中所述DNA模板的大小大于约200个核苷酸，其中所述DNA模板的5'和3'端包含与侧接所述插入位点的基因组序列具有同源性的核苷酸序列，并且其中所述复合物中RNP与DNA模板的摩尔比为约3:1至约100:1；和/nb)将所述RNP-DNA模板复合物导入细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170615 US 62/520,117;20170830 US 62/552,1801.一种编辑细胞基因组的方法，所述方法包括：
a)提供Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)-DNA模板复合物，其包含：
(i)所述RNP，其中所述RNP包含Cas9核酸酶结构域和向导RNA，其中所述向导RNA与所述细胞基因组的靶区域特异性地杂交，并且其中所述Cas9核酸酶结构域切割所述靶区域以在所述细胞的基因组中产生插入位点；和
(ii)双链或单链DNA模板，其中所述DNA模板的大小大于约200个核苷酸，其中所述DNA模板的5'和3'端包含与侧接所述插入位点的基因组序列具有同源性的核苷酸序列，并且其中所述复合物中RNP与DNA模板的摩尔比为约3:1至约100:1；和
b)将所述RNP-DNA模板复合物导入细胞。


2.如权利要求1所述的方法，其中，通过用所述DNA模板与所述RNP在约20°-25℃的温度孵育不到约1分钟至约30分钟形成所述RNP-DNA模板复合物。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述DNA模板是线性DNA模板。


4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述DNA模板是单链DNA模板。


5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述DNA模板是纯单链DNA模板。


6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，在将所述RNP-DNA模板复合物导入所述细胞之前，混合所述RNP-DNA模板复合物和所述细胞。


7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述RNP包含Cas9核酸酶。


8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述RNP包含Cas9切口酶。


9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述RNP-DNA模板复合物包含至少2种结构不同的RNP复合物。


10.如权利要求9所述的方法，其中，所述至少两种结构不同的RNP复合物包含结构不同的向导RNA。


11.如权利要求10所述的方法，其中，所述结构不同的...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·L·罗斯，A·马森，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US