一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶或有机磷农药的比色检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，包括：采用NaAc‑HAc缓冲溶液配制ACP溶液和AAP溶液，将多个不同浓度的ACP溶液与AAP溶液、MnO

A colorimetric detection method for acid phosphatase or organophosphorus pesticide based on manganese dioxide biomimetic oxidase activity

【技术实现步骤摘要】
一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶或有机磷农药的比色检测方法
本专利技术属于分析检测
，涉及一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶或有机磷农药的比色检测方法，更具体地，涉及一种基于二氧化锰的生物模拟氧化酶活性，用于酸性磷酸酶以及有机磷农药的检测。
技术介绍
酸性磷酸酶(ACP)是一种普遍存在的多功能酶，主要分布于哺乳动物的血液和组织中，在弱酸性条件下可以水解有机磷化合物的磷酸酯键。酸性磷酸酶作为一种磷酸单酯酶，它在调节细胞内各种生理变化中起着重要的作用。同时，大量研究指出，ACP的非正常表达与活化，与许多人类疾病存在关联性，包括甲状旁腺功能亢进、转移性前列腺癌、戈谢氏病、血栓性静脉炎以及与肾脏、静脉、骨骼等相关的疾病。因此，ACP被认为是一种重要的生物标志物和相关疾病的预后指标。此外，一些ACPs亚型如2C4型磷脂酸酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)被认为是潜在的药物靶点。因此，开发简便、灵敏、高选择性的ACP检测方法对临床诊断和药物筛选具有重要意义。近年来，人们探索了几种检测ACP的方法，包括分光光度法如荧光法和比色法、高效液相色谱法、表面声波传感器和电化学方法等。上述方法虽然能有效地定量检测ACP，但大多需要繁琐的样品制备、昂贵的信号标记和复杂的仪器操作。因此，建立一种简便灵敏的ACP定量检测体系成为目前生化分析和临床诊断的热点。有机磷农药作为一类重要的农药，对环境和农产品会产生有害的影响，继而对生态系统造成危害。此外，有机磷农药还会通过食物中的残留逐渐积累在体内，以及通过皮肤、呼吸道、嗅吸等途径对人体产生危害。Fariba等人比较了长期接触农药的农民与普通人之间的毒理学代谢指标，用于研究有机磷农药对人体的作用，结果显示，长期接触有机磷农药可能会抑制乙酰胆碱酯酶的活性继而导致中枢神经系统毒性，伴随着DNA氧化损伤和抑制免疫系统。因此，采用高灵敏度、高选择性、可靠的测定方法对有机磷农药浓度进行监测具有重要意义。根据以往的报道，有机磷酸酯(Ops)可以有效的抑制ACP的催化能力，从而通过此途径对其进行分析和检测。纳米酶因其与天然酶相媲美的高催化活性，且具有稳定性好、易合成、易修饰等优点而受到越来越多的关注。二氧化锰纳米片(MnO2nanosheets)是一种具有生物模拟氧化酶活性的二维纳米材料。具有皱褶二维平面结构的MnO2纳米片与其他金属纳米酶相比，具有更高的摩尔消光系数(9.6×103M-1·cm-1)、高比表面积、易于制备/修饰、良好的生物相容性和水溶性等优点。因此，它已成功地应用于电池、磁共振成像、传感、药物传递、催化和超级电容器等领域。综上所述，实现简便，快速、灵敏检测酸性磷酸酶和有机磷农药是现在研究的热点之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有酸性磷酸酶检测方法灵敏度低、检测耗时、成本过高以及步骤繁琐的缺点，提供一种基于二氧化锰生物模拟氧化酶活性建立的比色传感体系。在该比色传感体系中，底物2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)在二氧化锰纳米片的作用下由无色变为深绿色，在体系中加入抗坏血酸(AA)后，二氧化锰纳米片被分解成锰离子(Mn2+)，继而失去其生物模拟氧化酶活性，ABTS不会出现由无色到绿色的颜色变化。酸性磷酸酶(ACP)可以催化底物维生素C磷酸酯(AAP)转变为AA，故同样适用于本比色传感体系。此外，有机磷农药可以有效抑制ACP的活性，使其不能催化AAP产生AA使二氧化锰纳米片分解，所以也可通过本比色传感体系进行定性或定量的检测。综上，本专利技术成功构建了酸性磷酸酶或有机磷农药的比色传感体系(原理见图1)。原理验证见图2，当体系中只存在ABTS，无紫外吸收峰，溶液呈无色，仅存在MnO2纳米片时，溶液呈浅棕色，当上述两溶液混合时，在420nm处有强紫外吸收峰存在，溶液呈深绿色，这是因为MnO2纳米片具有生物模拟酶活性，可以使显色底物ABTS出现相应变化。在ABTS+MnO2纳米片体系中加入AA后，绿色褪去。在ABTS+MnO2纳米片体系中加入AAP，溶液仍呈深绿色。在ABTS+MnO2纳米片体系中加入AAP和ACP，绿色褪去，产生的变化与加入AA基本相似，这是由于AA可以使MnO2纳米片分解成Mn2+，失去生物模拟氧化酶活性引起的。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，包括如下步骤：步骤(a)、采用NaAc-HAc缓冲溶液配制ACP溶液和AAP溶液，将多个不同浓度的ACP溶液与其底物AAP溶液混合并孵育；步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系混合，进行孵育反应；步骤(c)、在步骤(b)得到的混合体系中加入显色底物ABTS溶液，进行孵育反应，获得比色传感体系；步骤(d)、在420nm波长处测定样品的紫外吸光度A；测定没有目标物ACP时，反应体系在420nm波长处的吸光度A0；利用测得的A0与A的吸光度差值ΔA，获得ACP浓度与吸光度差值ΔA的线性关系；步骤(e)、根据步骤(d)所得到的线性关系与待测样品的吸光度差值ΔA，得到待测样品中ACP的浓度。所述的比色传感体系中，AAP的浓度为1mM；ACP的浓度为0.075～3mU·mL-1；MnO2纳米片的浓度为0.015～0.15mg·mL-1，优选为0.075mg·mL-1；ABTS的浓度为2.5～10mM，优选为2.5mM。步骤(a)中，所述的NaAc-HAc缓冲溶液为0.2mol·L-1、pH4.6的NaAc-HAc缓冲溶液。所述的孵育为在36～38℃下孵育5～30min，优选为在37℃下孵育20min。步骤(b)中，所述的孵育为在36～38℃下孵育5～15min，优选为在37℃下孵育10min。所述的MnO2纳米片可根据本领域公知的方法制得。具体步骤如下：将50mg高锰酸钾溶于45mL超纯水中，室温下搅拌1h，然后缓慢加入15mgN,N,N-三甲基1-十六烷基溴化铵(CTAB)，匀速缓慢搅拌，直至形成稳定的乳状液；随后，逐滴加入5mL2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液(0.1M,pH6.0)，所得棕黑色溶液在室温下匀速搅拌过夜；最后，用超纯水溶液离心洗涤多次，直至上清液澄清，得到MnO2纳米片，真空干燥定量，用超纯水溶解超声，得到MnO2纳米片溶液。所述的MnO2纳米片也可以使用现有技术，如JournaloftheAmericanChemicalSociety,2008,130(47)：15938-15943中记载的方法进行制备。所述的MnO2纳米片溶液采用超纯水溶解超声配制而成。步骤(c)中，所述的孵育为在36～38℃下孵育5～60min，优选为在37℃下孵育50min。步骤(d)中，测定吸光度的方法为：将样品放置紫外可见分光光度计后进行200～800nm全波长扫描，扫描速度为1200nm/min，光电倍增管电压为750V，狭缝宽度为5nm，测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，其特征在于包括如下步骤：/n步骤(a)、采用NaAc-HAc缓冲溶液配制ACP溶液和AAP溶液，将多个不同浓度的ACP溶液与其底物AAP溶液混合并孵育；/n步骤(b)、将MnO

【技术特征摘要】
1.一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤(a)、采用NaAc-HAc缓冲溶液配制ACP溶液和AAP溶液，将多个不同浓度的ACP溶液与其底物AAP溶液混合并孵育；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系进行孵育反应；
步骤(c)、在步骤(b)得到的混合系统中加入显色底物ABTS，进行孵育反应，获得比色传感体系；
步骤(d)、在420nm波长处测定样品的紫外吸光度A；测定没有目标物ACP时，反应体系在420nm波长处的吸光度A0；利用测得的A0与A的吸光度差值ΔA，获得ACP浓度与吸光度差值ΔA的线性关系；
步骤(e)、根据步骤(d)所得到的线性关系与待测样品的吸光度差值ΔA，得到待测样品中ACP的浓度。


2.根据权利要求1所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，其特征在于步骤(a)中，所述的NaAc-HAc缓冲溶液为0.2mol·L-1、pH4.6的NaAc-HAc缓冲溶液。


3.根据权利要求1所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，其特征在于步骤(a)中，所述的孵育为在36～38℃下孵育15～25min，优选为在37℃下孵育20min；
步骤(b)中，所述的孵育为在36～38℃下孵育5～15min，优选为在37℃下孵育10min；
步骤(c)中，所述的孵育为在36～38℃下孵育5～60min，优选为在37℃下孵育50min。


4.根据权利要求1所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，其特征在于所述的比色传感体系中，AAP的浓度为1mM；ACP的浓度为0.075～3mU·mL-1；MnO2纳米片的浓度为0.015～0.15mg·mL-1，优选为0.075mg·mL-1；ABTS的浓度为2.5～10mM，优选为2.5mM。


5.根据权利要求1所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，其特征在于步骤(d)中，测定吸光度的方法为：将样品放置紫外可见分光光度计后进行200～800nm全波长扫描，扫描速度...

【专利技术属性】
技术研发人员：周学敏，王晶，李昺之，卢巧云，翁晨园，李晓芸，严孝强，杨威，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32