PLGA纳米纤维CTCs捕获基底、其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种PLGA纳米纤维CTCs捕获基底、其制备方法与应用。所述基底包括PLGA纳米纤维，连接于PLGA纳米纤维表面的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTCs亲和捕获分子。所述制备方法包括：通过静电纺丝技术将PLGA电纺液进行电纺获得PLGA纳米纤维构建的三维纳米结构；使用化学交联方式将抗粘附分子和CTCs亲和捕获分子修饰在PLGA纳米纤维上，获得PLGA纳米纤维CTCs捕获基底。本发明专利技术的CTCs捕获基底制备工艺简便、修饰过程稳定、生物兼容性好、可给CTCs捕获提供仿ECM结构的三维附着环境，并能实现对上皮特性和间质特征两种表型CTCs在三维PLGA纳米纤维上的粘附和特异性捕获。

PLGA nanofiber CTC capture substrate, its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
PLGA纳米纤维CTCs捕获基底、其制备方法与应用
本专利技术涉及一种PLGA纳米纤维CTCs捕获基底，具体的涉及一种基于双抗体修饰PLGA纳米纤维的两种表型CTCs特异性捕获基底及其制备方法，以及该PLGA纳米纤维CTCs捕获基底在两种表型CTCs特异性捕获方面的应用，属于纳米生物

技术介绍
循环肿瘤细胞(CTC)指的是一种从肿瘤原发病灶脱落的进入血液循环的具有转移活性的癌细胞，它可以随着血液的循环流动在全身游走，因而CTC可以进入身体的其它任何组织、器官等部位进行吸附、生长进而产生次级病灶--转移瘤，这可造成恶性肿瘤患者病程进展加剧；癌症的高复发率和患者的高死亡率主要是由肿瘤的转移和侵袭导致的，产生这种结果的绝大多数原因则是源于CTC远端转移和侵袭生长所导致的。作为多种实体瘤的预后标志物之一，CTC检测在临床应用方面面临巨大机遇，例如癌症筛检和早期诊断、治疗实时监控、转移复发风险预测、药物作用靶点和耐药机制研究等等均可通过对CTC的监测和研究得出结果。因此，对CTCs的研究可以为临床诊断等方面提供重要的生物相关信息，而对发展不同表型CTC的特异性分离捕获具有极其重要的意义。目前对于CTCs的分离捕获技术大部分依赖于上皮特性的生物特性，然而，当肿瘤细胞处于EMT阶段或低表达EpCAM抗体时，则无法捕捉这类细胞。正是这些“隐身”的肿瘤细胞致使癌症发生了转移，推进了癌症进程。同时，近期研究表明EMT特性CTC作为潜在生物标志物在耐药机制的研究中比上皮特性CTC更有意义；若只利用上皮特性生物标志物进行CTC捕获，极易导致假阴性癌细胞的漏筛。然而，到目前为止很少有研究针对间质特性CTC进行捕获。另外随着纳米材料领域的快速发展，与平面基底相比，纳米结构基底的比表面积更大，细胞与基底接触的机会也相应增加，同时纳米结构基底修饰的亲和捕获分子更多，更有利于CTC的捕获。然而采用针对上皮特性CTC和EMT特性CTC的生物标志物蛋白修饰的三维纳米结构基底-PLGA纳米纤维技术还没有应用于两种表型CTCs的捕获研究，因此，如何构建可以实现同时捕获上皮特性CTC和EMT特性CTC的纳米纤维基底尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种基于双抗体修饰PLGA纳米纤维的两种表型CTCs特异性捕获基底，该基底在纳米界面上对分子识别作用进行设计，将抗粘附分子与亲和捕获分子的作用进行有效结合，能够有效抑制细胞的非特异性粘附和有效识别靶细胞的特异性捕获，进而实现两同表型CTCs的特异性捕获。本专利技术的另一目的在于提供一种制备所述基于双抗体修饰PLGA纳米纤维的两种表型CTCs特异性捕获基底的方法，该方法制备工艺简便、成本价格低廉、修饰过程稳定，并可给CTCs捕获提供仿ECM结构的三维附着环境。本专利技术的又一目的在于提供所述基于双抗体修饰PLGA纳米纤维的两种表型CTCs特异性捕获基底的用途。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种PLGA纳米纤维CTCs捕获基底，其包括PLGA纳米纤维，连接于PLGA纳米纤维表面的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTCs亲和捕获分子。在一较佳实施方案之中，所述PLGA纳米纤维CTCs捕获基底包括主要由分布在基材表面的直径为100～500nm的PLGA纳米纤维堆积而成的三维纳米结构。进一步地，所述抗粘附分子包括牛血清白蛋白。进一步地，所述CTCs亲和捕获分子包括抗上皮细胞粘附分子抗体与抗神经-钙黏蛋白抗体的修饰化产物。本专利技术实施例还提供了前述PLGA纳米纤维CTCs捕获基底的制备方法，其包括：(1)将分子量为90～110kDa、由LA与GA按照质量比为5：1～6：1聚合形成的PLGA结晶体溶于有机溶剂体系中形成均匀、粘稠、透明PLGA电纺液；(2)以静电纺丝装置将所述PLGA电纺液通过静电纺丝方式施加于基材表面，形成PLGA纳米纤维构建的三维纳米结构；(3)在所述PLGA纳米纤维表面连接抗粘附分子；(4)将CTCs亲和捕获分子与连接在所述PLGA纳米纤维表面的抗粘附分子偶联，获得基于双抗体修饰的PLGA纳米纤维CTCs捕获基底。本专利技术实施例还提供了前述PLGA纳米纤维CTCs捕获基底在两种表型CTCs特异性捕获中的应用。其中进一步地，应用所述PLGA纳米纤维CTCs捕获基底进行CTCs特异性捕获的方法包括如下步骤：将上皮特性CTC和间质特性CTC与所述PLGA纳米纤维CTCs捕获基底在细胞培养箱中孵育，对基底所捕获CTCs进行鉴定并计数。例如，其中的一种应用方案可以是：一种CTCs捕获方法，包括：将上皮特性CTC和间质特性CTC与所述PLGA纳米纤维CTCs捕获基底在细胞培养箱中孵育，对基底所捕获CTCs进行鉴定并计数。与现有技术相比，本专利技术至少具有如下有益效果：1)基于双抗体修饰PLGA纳米纤维的两种表型CTCs特异性捕获基底可以提供细胞相容性良好的三维纳米界面，该界面通过仿ECM中水平去向的纳米网架结构的方式，能够改善细胞与基底的亲和力，使得该基底能够较好的与细胞表面的微、纳米结构匹配和作用；2)该CTCs捕获基底在修饰特异性捕获分子的基础上，引入抗粘附分子能够保证高效捕获靶细胞的前提下降低非靶细胞的非特异性粘附；3)本专利技术通过双抗体的联合使用，不仅规避了只能识别上皮特性CTC细胞的缺陷，而且可以特异性的识别间质特性CTC细胞和上皮特性CTC细胞两种不同属性的CTCs；该基底在纳米界面上对分子识别作用进行设计，将抗粘附分子与亲和捕获分子的作用进行有机结合，能够有效抑制细胞的非特异性粘附和有效识别靶细胞的特异性捕获，进而实现两同表型CTCs的特异性捕获；4)利用本专利技术的制备方法，所述静电纺丝纳米纤维的制备方法对不同性质的材料具有普适性；且制作工艺简单，整体成本低廉，修饰过程稳定，并可给CTCs捕获提供仿ECM结构的三维附着环境适合于科学研究中；5)该方法制得的PLGA纳米纤维膜基底具有一定的透明度，在CTC捕获基底的应用中实用性强。附图说明图1是本专利技术一典型实施例中利用一种基于双抗体修饰PLGA纳米纤维的两种表型CTCs特异性捕获的整体示意图。图2是本专利技术一典型实施例中用以进行静电纺丝的静电纺丝设备组成示意图。图3是本专利技术一典型实施例中以静电纺丝工艺制备的PLGA纳米纤维膜基底表面扫描电镜图像。图4是本专利技术一典型实施例中对PLGA纳米纤维基底进行界面化学修饰的原理图。图5a是本专利技术一典型实施例中不同化学分子修饰的PLGA纳米纤维膜基底上单个细胞单独捕获时的捕获效率对比图。图5b是本专利技术一典型实施例中不同化学分子修饰的PLGA纳米纤维膜基底上单个细胞单独捕获时的捕获荧光照片。图6a是本专利技术一典型实施例中不同化学分子修饰的PLGA纳米纤维膜基底上混合两种细胞捕获时的捕获效率对比图。图6b是本专利技术一典型实施例中不同化学分子修饰的P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PLGA纳米纤维CTCs捕获基底，其特征在于包括PLGA纳米纤维，连接于PLGA纳米纤维表面的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTCs亲和捕获分子。/n

【技术特征摘要】
1.一种PLGA纳米纤维CTCs捕获基底，其特征在于包括PLGA纳米纤维，连接于PLGA纳米纤维表面的抗粘附分子以及与所述抗粘附分子连接的CTCs亲和捕获分子。


2.根据权利要求1所述的PLGA纳米纤维CTCs捕获基底，其特征在于：所述PLGA纳米纤维CTCs捕获基底包括主要由分布在基材表面的直径为100～500nm的PLGA纳米纤维堆积而成的三维纳米结构；优选的，所述PLGA为高分子聚合产物；优选的，所述PLGA纳米纤维由LA与GA聚合而成。


3.根据权利要求1所述的PLGA纳米纤维CTCs捕获基底，其特征在于：所述抗粘附分子包括牛血清白蛋白。


4.根据权利要求1所述的PLGA纳米纤维CTCs捕获基底，其特征在于：所述CTCs亲和捕获分子包括抗上皮细胞粘附分子抗体与抗神经-钙黏蛋白抗体的修饰化产物。


5.如权利要求1-4中任一项所述PLGA纳米纤维CTCs捕获基底的制备方法，其特征在于包括：
(1)将分子量为90～110kDa、由LA与GA按照质量比为5：1～6：1聚合形成的PLGA结晶体溶于有机溶剂体系中形成均匀、粘稠、透明PLGA电纺液；
(2)以静电纺丝装置将所述PLGA电纺液通过静电纺丝方式施加于基材表面，形成PLGA纳米纤维构建的三维纳米结构；
(3)在所述PLGA纳米纤维表面连接抗粘附分子；
(4)将CTCs亲和捕获分子与连接在所述PLGA纳米纤维表面的抗粘附分子偶联，获得基于双抗体修饰的PLGA纳米纤维CTCs捕获基底。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(1)具体包括：将PLGA结晶体溶于有机溶剂体系中，于室温下搅拌过夜，获得透明均一的粘稠PLGA电纺液；优选地，所述有机溶剂体系包括N，N-二甲基甲酰胺溶液和四氢呋喃溶液的混合液，其中所述的N，N-二甲基甲酰胺溶液与四氢呋喃溶液的体积比为2：1～3：1；优选的，所述PLGA电纺液中PLGA结晶体的含量为25wt.％～35wt.％。

【专利技术属性】
技术研发人员：裴仁军，刘慧，孙娜，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32