m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用制造技术

本发明专利技术公开一种m6A修饰相关基因ALKBH5在制备治疗神经轴突损伤相关疾病药物中的应用。本发明专利技术还公开一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：S1、检测ALKBH5的表达及定位；S2、干扰ALKBH5的表达对神经元轴突生长的影响；S3、干扰ALKBH5的表达对坐骨神经轴突生长的影响；S4、ALKBH5靶基因LPIN2的筛选及功能检测的过程。本发明专利技术验证了体内外干扰ALKBH5基因均能显著促进神经元轴突的生长，促进坐骨神经功能的恢复；并通过ALKBH5干扰后的转录组分析及靶基因验证，寻找ALKBH5调控的靶基因LPIN2，验证在调控神经元轴突生长中的作用。

The application of the gene alkbh5 modified by m6A in promoting the repair of axon injury

【技术实现步骤摘要】
m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用
本专利技术属于生物医学研究
，具体涉及m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用。
技术介绍
随着人类社会的发展，战争、车祸及运动伤等引起的周围神经损伤有着较高发病率，给患者带来巨大伤害，也造成严重的社会和家庭负担。目前基于显微外科手术、局部外周神经的移植或组织工程材料的应用对于周围神经损伤的治疗有着很大的局限性，主要表现在长距离周围神经损伤治疗困难及神经功能的部分丧失，其关键原因是对于神经损伤修复中关键的调控分子靶点及调控的分子机制尚不完全阐明。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种m6A修饰相关基因ALKBH5在制备治疗神经轴突损伤相关疾病药物中的应用，以解决
技术介绍
中所提出的问题。为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种m6A修饰相关基因ALKBH5在制备治疗神经轴突损伤相关疾病药物中的应用。进一步的，所述神经轴突损伤相关疾病包括周围及中枢神经损伤。本专利技术的实施例还提供一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：S1、检测ALKBH5的表达及定位：制备大鼠坐骨神经损伤模型，通过Westernblot检测坐骨神经损伤的大鼠模型中DRG组织中ALKBH5的表达变化；通过免疫荧光检测坐骨神经损伤的大鼠模型在术后不同时间点内DRG中ALKBH5表达并定位；S2、干扰ALKBH5的表达对神经元轴突生长的影响：分离培养DRG神经元；通过注射AAV病毒，使DRG神经元病毒感染，干扰ALKBH5的表达；体外神经元轴突生长实验检测干扰ALKBH5对神经元轴突生长的影响；S3、干扰ALKBH5的表达对坐骨神经轴突生长的影响：选择实验用动物SD大鼠，鞘内注射干扰病毒；鞘内注射2周后再进行坐骨神经夹伤；对坐骨神经夹伤的大鼠进行灌流和脱水；坐骨神经轴突染色实验检测体内干扰ALKBH5对坐骨神经轴突生长的影响；S4、ALKBH5靶基因LPIN2的筛选及功能检测：筛选ALKBH5靶基因LPIN2；分离培养DRG神经元；DRG神经元中LPIN2干扰RNA的转染；体外神经元轴突生长实验，干扰ALKBH5靶基因LPIN2，检测对神经元轴突生长的影响。其中，所述步骤S1中，大鼠坐骨神经夹伤模型的制备过程如下：选取实验用SD大鼠，每批15只，成年雄鼠，体重180-220g；将大鼠分成3组，每组5只；手术前，首先对大鼠进行腹腔麻醉，再将左侧后肢被毛消毒；用手术剪暴露皮肤，再用眼科剪钝性分离覆盖住坐骨神经的肌肉与基膜，使用夹伤钳夹住坐骨神经近端，夹伤处3mm宽，夹伤持续30s，夹伤结束后将坐骨神经收回肌肉下，最后将伤口缝合；术后的鼠注意保暖，并对其注射1ml生理盐水加速麻药代谢出体外；夹伤3d后，在夹伤缝合处涂抹碘伏后用手术剪剪开皮肤，换眼科剪钝性分离覆盖住坐骨神经的基膜与肌肉，暴露出坐骨神经后找到夹伤位置，以夹伤位置为标记，收取坐骨神经组织置于甲醛溶液中。其中，所述步骤S1中DRG样本蛋白质提取、Westernblot检测及免疫荧光检测，具体还包括以下过程：DRG样本蛋白质提取及Westernblot实验：制备大鼠坐骨神经夹伤模型后，取术后0h，1d及3d坐骨神经夹伤侧的L4-L6背根神经节（DRG）组织，通过组织样本蛋白质提取试剂盒进行组织蛋白样本制备；将不同时间点的L4、L5DRG组织用吸头从冻存管中转移至1.5mlEP管中；向管中加入150ul组织裂解液，使用匀浆器将组织打成单细胞悬液后置于冰上裂解15min后，离心10min；取出离心管，吸取上清至新EP管中，检测样本中的蛋白浓度，测定并记录蛋白质样品的浓度，吸取一部分样品进行蛋白质变性，剩余样本做好标记储存在-80℃中；根据所测样本的蛋白质浓度，加入适量的6Xloading蛋白质上样缓冲液，混匀后95℃变性10min；制备聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白质样本进行SDS-PAGE电泳，120V100min，转膜100v40min，用5%脱脂乳封闭室温2h，4℃孵育一抗ALKBH5，GAPDH过夜后，二抗Rabbit-HRP室温孵育2h，用ECL进行显影；免疫荧光检测：DRG中ALKBH5的免疫荧光检测：制备大鼠坐骨神经夹伤模型后，取术后0h及3d坐骨神经夹伤侧的L4-L6背根神经节（DRG）组织，经4%PFA固定后制作冰冻切片；FISH检测首先对切片样本进行0.3%TBST室温清洗2次，10min/次，室温封闭1h后4℃孵育一抗ALKBH5，Neun过夜后，荧光二抗Rabbit-488及Mouse-594室温避光孵育2h，荧光显微镜观察摄片。其中，所述步骤S2和步骤S4中，分离培养DRG神经元，具体包括以下过程：准备解剖液放入小皿中，加入双抗（青霉素和链霉素）后置于冰上预冷；腹腔麻醉3只大鼠，用手术剪从尾部沿脊椎向头部剪开皮肤，剔出整根脊柱，从颈部开始打开椎板，用显微镊拽出所有DRG组织放入解剖液中；弃去解剖液，用PBS淋洗组织2遍；弃去PBS，加入2ml胶原酶，将组织及消化液转移至5ml离心管中；用显微剪充分剪碎组织后放入细胞培养箱中，消化90min；离心弃去胶原酶，加入1ml胰酶消化液，用枪吹打1min至组织分散均匀，放进细胞培养箱消化10min，每5min拿出吹打均匀再放回培养箱；待组织消化至无明显组织块，向离心管中加入3ml消化终止液终止消化；用枪吹打1min，过筛网，滤掉多余组织并收集细胞悬液至新的5ml离心管中离心弃去上清；向离心管中加入4ml提前预热的BSA溶液，重悬细胞，9000rpm离心5min，吸弃漂浮的杂细胞；再重复一遍此过程；加入提前预热的神经元培养基，吹打细胞均匀后接种到6孔板中，十字混匀细胞后放入5%CO2，37℃培养箱中。其中，所述步骤S2中，DRG神经元病毒感染，包括以下过程：观察细胞贴壁情况良好后，在细胞接种24h内，加入AVV病毒，病毒感染量控制在2×104v.g./cell；病毒加入24h内将感染培养基弃去，换成新鲜完全培养基；病毒感染96h后，观察到细胞表达GFP荧光较强时收取细胞。其中，所述步骤S2和步骤S4中，体外神经元轴突生长实验，具体包括以下步骤：染色前对细胞进行病毒预感染96h，观察病毒表达GFP荧光亮度较亮即可进行染色；弃去细胞培养基，加入预热后的1×PBS润洗细胞；弃去1×PBS，加入预冷的4%多聚甲醛，冰上固定20min；弃去甲醛后，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次；清洗结束后弃去PBS，滴加封闭液，每孔200μl，室温静置40min；弃去封闭液，轻轻滴加用一抗稀释液稀释Anti-β-TublinⅢantibody，每孔200μl，4℃静置孵育过夜；弃去一抗，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次；弃去PBS，轻轻滴加用二抗稀释液稀释的Alexafluor647goatanti-rabbit，每孔200μl，室本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种m6A修饰相关基因ALKBH5在制备治疗神经轴突损伤相关疾病药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种m6A修饰相关基因ALKBH5在制备治疗神经轴突损伤相关疾病药物中的应用。


2.根据权利要求1所述的一种m6A修饰相关基因ALKBH5在制备治疗周围神经损伤的药物中的应用，其特征在于，所述神经轴突损伤相关疾病包括周围及中枢神经损伤。


3.一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、检测ALKBH5的表达及定位：制备大鼠坐骨神经损伤模型，通过Westernblot检测坐骨神经损伤的大鼠模型中DRG组织中ALKBH5的表达变化；通过免疫荧光检测坐骨神经损伤的大鼠模型在术后不同时间点内DRG中ALKBH5表达并定位；
S2、干扰ALKBH5的表达对神经元轴突生长的影响：分离培养DRG神经元；通过注射AAV病毒，使DRG神经元病毒感染，干扰ALKBH5的表达；体外神经元轴突生长实验检测干扰ALKBH5对神经元轴突生长的影响；
S3、干扰ALKBH5的表达对坐骨神经轴突生长的影响：选择实验用动物SD大鼠，鞘内注射干扰病毒；鞘内注射2周后再进行坐骨神经夹伤；对坐骨神经夹伤的大鼠进行灌流和脱水；坐骨神经轴突染色实验检测体内干扰ALKBH5对坐骨神经轴突生长的影响；
S4、ALKBH5靶基因LPIN2的筛选及功能检测：筛选ALKBH5靶基因LPIN2；分离培养DRG神经元；DRG神经元中LPIN2干扰RNA的转染；体外神经元轴突生长实验，干扰ALKBH5靶基因LPIN2，检测对神经元轴突生长的影响。


4.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，所述步骤S1中，大鼠坐骨神经夹伤模型的制备过程如下：
选取实验用SD大鼠，每批15只，成年雄鼠，体重180-220g；将大鼠分成3组，每组5只；手术前，首先对大鼠进行腹腔麻醉，再将左侧后肢被毛消毒；用手术剪暴露皮肤，再用眼科剪钝性分离覆盖住坐骨神经的肌肉与基膜，使用夹伤钳夹住坐骨神经近端，夹伤处3mm宽，夹伤持续30s，夹伤结束后将坐骨神经收回肌肉下，最后将伤口缝合；术后的鼠注意保暖，并对其注射1ml生理盐水加速麻药代谢出体外；夹伤3d后，在夹伤缝合处涂抹碘伏后用手术剪剪开皮肤，换眼科剪钝性分离覆盖住坐骨神经的基膜与肌肉，暴露出坐骨神经后找到夹伤位置，以夹伤位置为标记，收取坐骨神经组织置于甲醛溶液中。


5.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，其特征在于，所述步骤S1中DRG样本蛋白质提取、Westernblot检测及免疫荧光检测，具体还包括以下过程：
DRG样本蛋白质提取及Westernblot检测：制备大鼠坐骨神经夹伤模型后，取术后0h，1d及3d坐骨神经夹伤侧的L4-L6背根神经节（DRG）组织，通过组织样本蛋白质提取试剂盒进行组织蛋白样本制备；将不同时间点的L4、L5DRG组织用吸头从冻存管中转移至1.5mlEP管中；向管中加入150ul组织裂解液，使用匀浆器将组织打成单细胞悬液后置于冰上裂解15min后，离心10min；取出离心管，吸取上清至新EP管中，检测样本中的蛋白浓度，测定并记录蛋白质样品的浓度，吸取一部分样品进行蛋白质变性，剩余样本做好标记储存在-80℃中；根据所测样本的蛋白质浓度，加入适量的6Xloading蛋白质上样缓冲液，混匀后95℃变性10min；制备聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白质样本进行SDS-PAGE电泳，120V100min，转膜100v40min，用5%脱脂乳封闭室温2h，4℃孵育一抗ALKBH5，GAPDH过夜后，二抗Rabbit-HRP室温孵育2h，用ECL进行显影；
免疫荧光检测：DRG中ALKBH5的免疫荧光检测：制备大鼠坐骨神经夹伤模型后，取术后0h及3d坐骨神经夹伤侧的L4-L6背根神经节（DRG）组织，经4%PFA固定后制作冰冻切片；FISH检测首先对切片样本进行0.3%TBST室温清洗2次，10min/次，室温封闭1h后4℃孵育一抗ALKBH5，Neun过夜后，荧光二抗Rabbit-488及Mouse-594室温避光孵育2h，荧光显微镜观察摄片。


6.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修复方面的应用，所述步骤S2和步骤S4中，分离培养DRG神经元，具体包括以下过程：
准备解剖液放入小皿中，加入双抗后置于冰上预冷；腹腔麻醉3只大鼠，用手术剪从尾部沿脊椎向头部剪开皮肤，剔出整根脊柱，从颈部开始打开椎板，用显微镊拽出所有DRG组织放入解剖液中；弃去解剖液，用PBS淋洗组织2遍；弃去PBS，加入2ml胶原酶，将组织及消化液转移至5ml离心管中；用显微剪充分剪碎组织后放入细胞培养箱中，消化90min；离心弃去胶原酶，加入1ml胰酶消化液，用枪吹打1min至组织分散均匀，放进细胞培养箱消化10min，每5min拿出吹打均匀再放回培养箱；待组织消化至无明显组织块，向离心管中加入3ml消化终止液终止消化；用枪吹打1min，过筛网，滤掉多余组织并收集细胞悬液至新的5ml离心管中离心弃去上清；向离心管中加入4ml提前预热的BSA溶液，重悬细胞，9000rpm离心5min，吸弃漂浮的杂细胞；再重复一遍此过程；加入提前预热的神经元培养基，吹打细胞均匀后接种到6孔板中，十字混匀细胞后放入5%CO2，37℃培养箱中。


7.根据权利要求3所述的一种实验性验证m6A修饰相关基因ALKBH5在促进神经轴突损伤修...

【专利技术属性】
技术研发人员：于彬，王东，刘明稳，顾晓松，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32