一种低成本提取干燥植物叶片DNA的方法与应用技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体公开了一种低成本提取干燥植物叶片DNA的方法，先对叶片进行干燥、研磨成粉；然后加入裂解缓冲液和RNase A混匀后水浴提取，加入醋酸钠溶液混匀，离心取上清液；在上清液中加入硅粉‑DNA吸附液沉淀DNA，离心，弃去上清液；加入洗脱液洗沉淀DNA，重复1~2次；最后加入TE buffer溶解DNA，混匀，室温放置后离心，取上清液，即为提取的植物DNA。本发明专利技术的提取方法可用于百香果、甘蔗、红薯、木薯、荸荠等植物叶片总DNA提取，可从植物的幼叶、中等成熟叶片以及成熟叶片中提取，取样不受时间限制，提取的植物DNA纯度高，完整性好。提取方法避免采用氯仿、苯酚等有毒有机物，且提取工艺简单。

A low cost method of extracting DNA from dried plant leaves and its application

【技术实现步骤摘要】
一种低成本提取干燥植物叶片DNA的方法与应用
本专利技术属于分子生物学
，特别涉及一种低成本提取干燥植物叶片DNA的方法与应用。
技术介绍
DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，获得高质量DNA的是分子生物学实验最关键的第一步。与动物相比植物细胞除有细胞壁外，还含有较多的多糖、多酚等多种不易与DNA分离的次生代谢物，使得植物DNA提取的难度较大、成功率低，在植物DNA提取中DNA的溶液常出现黏度大乃至呈胶状，主要是由于多糖、酚类在提取过程中与DNA共沉淀，形成包裹DNA的黏稠胶状物，难以溶解或产生褐变，严重影响了DNA质量和纯度，而且用于DNA提取的组织(如叶片)的成熟度也常常难以控制。目前常用的植物DNA提取方法有：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法、SDS(十二烷基硫酸钠)法和试剂盒法，采用CTAB法和SDS法这两种方法可从几乎所有植物较为幼嫩的叶片中提取植物DNA，费用低廉，但是这两种方法存在以下不足：一是需要采用春季幼嫩未完全展开的叶片进行提取，取样时间受限，增加了叶片保鲜保存工作量；二是提取时间长；三是多数情况下要使用有毒的有机物进行提取，氯仿、苯酚被用于抽提以除去蛋白质和多糖，β-巯基乙醇被用于防止多酚类物质的氧化，异丙醇用于沉淀DNA。其中氯仿和β-巯基乙醇极易挥发，经呼吸系统或皮肤吸收入人体后可引起中毒，且为高毒；异丙醇有一定挥发性，对人体表现为低毒，但在常温下可引火燃烧，其蒸汽与空气的混合易形成爆炸混合物；苯酚虽无挥发性但可燃，对人体表现为高毒。这些有机溶剂不仅会对人体产生伤害，而且对自然环境造成严重危害。使用试剂盒提取方法，简单快速且无有机抽提，但是价格昂贵，适用范围小。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种低成本提取干燥植物叶片DNA的方法与应用，从而克服
技术介绍
中的缺陷。为实现上述目的，本专利技术提供了一种低成本提取干燥植物叶片DNA的方法，包括以下步骤：(1)取植物叶片放入装有钢珠的离心管中，干燥后通过研磨仪研磨成粉；(2)向步骤(1)中的离心管内加入裂解缓冲液和RNaseA，混匀，50～60℃水浴15～20min；(3)向步骤(2)中的离心管内加入醋酸钠溶液，混匀，冰浴4～6min，室温下离心，取上清液；(4)将步骤(3)取得的上清液加入装有硅粉-DNA吸附液的离心管中，混匀，室温放置15～20min后离心，弃上清液；(5)加入洗脱液，混匀，室温下离心，弃上清液；(6)重复步骤(5)1～2次；(7)室温下离心，置于超净台上晾干30～40min；(8)加入TEbuffer溶解DNA，混匀，室温放置5～8min后离心，取上清液，即为提取的植物DNA，-20℃下保存备用。优选的，上述提取干燥植物叶片DNA的方法中，将SDS溶于10*TE缓冲液得到裂解缓冲液，所述SDS质量与所述10*TE缓冲液体积比为5g:1L。优选的，上述提取干燥植物叶片DNA的方法中，所述步骤(4)中硅粉-DNA吸附液制备方法为：S1.将硅粉加入离心管中；S2.向步骤S1中离心管加入dH2O，涡旋混匀15～20min，弃去液体，所述dH2O体积与步骤S1中硅粉的质量比为30mL:800mg；S3.重复步骤S2两次；S4.加入dH2O，充分混匀得到硅粉悬浮液，所述硅粉悬浮液中硅粉与dH2O体积比为1:1；S5.取步骤S4得到的硅粉悬浮液于离心管，加dH2O涡旋混匀，11000～13000rpm离心10～20sec，弃上清液，所述硅粉悬浮液与dH2O的体积比为0.05:1；S6.加入KI溶液，充分混匀得到硅粉-DNA吸附液，所述KI溶液溶度为6mol/L，所述KI溶液与步骤S5中硅粉悬浮液的体积比为700:50。优选的，上述提取干燥植物叶片DNA的方法中，采用95％乙醇将NaCl溶液稀释100倍得到洗脱液，所述NaCl溶液浓度为5mol/L，所述洗脱液现配现用。优选的，上述提取干燥植物叶片DNA的方法中，所述醋酸钠溶液浓度为2～3mol/L，PH为5.2；所述RNaseA浓度为10mg/mL。优选的，上述提取干燥植物叶片DNA的方法中，每100mg所述植物叶片，所需的所述裂解缓冲液体积为800μL，所需的所述RNaseA体积为15μL，所需的所述醋酸钠溶液体积为200μL，所需的所述硅粉-DNA吸附液体积为700μL，所需的所述洗脱液体积为500μL，所需的所述TE缓冲液体积为150μL。优选的，上述提取干燥植物叶片DNA的方法中，所述混匀为漩涡混匀；所述步骤(1)研磨转速为1500r/min，研磨时间2min；所述步骤(3)、(4)或(8)中离心条件为：11000～13000rpm，5～8min；所述步骤(5)离心条件为：11000～13000rpm，3～5min；所述步骤(7)离心条件为：11000～13000rpm，0.5～1min。优选的，上述提取干燥植物叶片DNA的方法中，所述离心管包括管体和管盖，所述管体上端开口，上部为圆柱体部、下部为圆锥体部，所述上部和下部连接并呈一体结构；在所述管体上部内壁设置凸起的竖直条状结构，所述竖直条状结构与所述管体衔接处为圆角过渡；所述管盖匹配盖于所述管体顶端，所述管盖上开设有用于注入溶液的加液孔和用于抽取溶液的吸液孔，所述加液孔和吸液孔上配有弹性橡胶盖。上述提取干燥植物叶片DNA的方法在百香果、甘蔗、红薯、木薯或荸荠植物总DNA提取的应用。优选的，上述应用中，所述百香果或荸荠植物总DNA用于遗传多样性Scot分子标记。与现有的技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1.本专利技术中的提取干燥植物叶片DNA的方法可用于百香果、甘蔗、红薯、木薯、荸荠等单子叶和双子叶植物叶片总DNA提取，可从植物的幼叶、中等成熟叶片以及成熟叶片中提取，取样不受时间限制，可进行大批量样品常温采集，减少样品保鲜保存工作量，适用范围广。2.本专利技术的提取方法避免采用氯仿、苯酚等有毒有机物，对操作者的健康无损害，对环境的污染程度很小。采用的试剂均为常规的化学试剂，价格低廉，未使用离心柱等昂贵耗材，降低了提取成本。3.本专利技术提供的提取干燥植物叶片DNA的方法提取DNA的纯度高，完整性好，产率高，可满足PCR反应对DNA的质量要求。且提取工艺简单，适合大规模的推广和应用。附图说明图1是本专利技术的实施例2中离心管的剖视结构图，其中1-管体，2-管盖，3-竖直条状结构，4-加液孔，5-吸液孔，6-弹性橡胶盖，7-盖板，8-密封扣，9-软连接带，10-圆柱状环形支撑结构。图2是本专利技术的实验例1中百香果叶片总DNA琼脂糖检测电泳图，其中M为DNAMarkerDL5000，泳道1～9为实施例1方法提取得到的总DNA样品，泳道10～18为试剂盒提取得到的总DNA样品。图3是本专利技术的实验例1中甘蔗叶和红薯叶片总DNA琼脂糖检测电泳图，其中M为DNAMarkerDL5000，泳道1～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低成本提取干燥植物叶片DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）取植物叶片放入装有钢珠的离心管中，干燥后通过研磨仪研磨成粉；/n（2）向步骤（1）中的离心管内加入裂解缓冲液和RNase A，混匀，50~60℃水浴15~20min；/n（3）向步骤（2）中的离心管内加入醋酸钠溶液，混匀，冰浴4~6min，室温下离心，取上清液；/n（4）将步骤（3）取得的上清液加入装有硅粉-DNA吸附液的离心管中，混匀，室温放置15~20min后离心，弃上清液；/n（5）加入洗脱液，混匀，室温下离心，弃上清液；/n（6）重复步骤（5）1~2次；/n（7）室温下离心，晾干30~40min；/n（8）加入TE buffer溶解DNA，混匀，室温放置5~8min后离心，取上清液，即为提取的植物DNA，-20°C下保存备用。/n

【技术特征摘要】
1.一种低成本提取干燥植物叶片DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取植物叶片放入装有钢珠的离心管中，干燥后通过研磨仪研磨成粉；
（2）向步骤（1）中的离心管内加入裂解缓冲液和RNaseA，混匀，50~60℃水浴15~20min；
（3）向步骤（2）中的离心管内加入醋酸钠溶液，混匀，冰浴4~6min，室温下离心，取上清液；
（4）将步骤（3）取得的上清液加入装有硅粉-DNA吸附液的离心管中，混匀，室温放置15~20min后离心，弃上清液；
（5）加入洗脱液，混匀，室温下离心，弃上清液；
（6）重复步骤（5）1~2次；
（7）室温下离心，晾干30~40min；
（8）加入TEbuffer溶解DNA，混匀，室温放置5~8min后离心，取上清液，即为提取的植物DNA，-20°C下保存备用。


2.根据权利要求1所述的提取干燥植物叶片DNA的方法，其特征在于，所述步骤（2）中裂解缓冲液的制备方法为：将SDS溶于10*TE缓冲液得到裂解缓冲液，所述SDS质量与所述10*TE缓冲液体积比为5g:1L。


3.根据权利要求1所述的提取干燥植物叶片DNA的方法，其特征在于，所述步骤（4）中硅粉-DNA吸附液制备方法为：
S1.将硅粉加入离心管中；
S2.向步骤S1中离心管加入dH2O，涡旋混匀15~20min，弃去液体，所述dH2O体积与步骤S1中硅粉的质量比为30mL:800mg；
S3.重复步骤S2两次；
S4.加入dH2O，充分混匀得到硅粉悬浮液，所述硅粉悬浮液中硅粉与dH2O体积比为1:1；
S5.取步骤S4得到的硅粉悬浮液于离心管，加dH2O涡旋混匀，11000~13000rpm离心10~20sec，弃上清液，所述硅粉悬浮液与dH2O的体积比为0.05:1；
S6.加入KI溶液，充分混匀得到硅粉-DNA吸附液，所述KI溶液溶度为6mol/L，所述KI溶液与步骤S5中硅粉悬浮液的体积比为700:50。


4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄诚梅，罗海斌，曹辉庆，吴凯朝，魏源文，邓智年，江文，蒋胜理，徐林，叶丽萍，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：广西;45