一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种虾夷扇贝裙边多糖，以虾夷扇贝加工产生的裙边副产物为原料，通过酶解和色谱分离等过程制备得到一种酸性多糖成分，其含有硫酸基，由多种单糖残基构成，主要由类似肝素结构(→4)β‑GlcA(1→4)α‑GlcNAc→)的糖链和类似硫酸软骨素结构(→4)β‑GlcA(1→3)‑GalNAc→)的糖链组成。所述虾夷扇贝裙边多糖具有提高细胞产生一氧化氮含量和提高细胞因子转录水平的免疫刺激作用。

A kind of Polysaccharide from scallop skirt and its extraction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用
本专利技术总地涉及活性多糖
，具体涉及一种虾夷扇贝裙边多糖及其提取方法和应用。
技术介绍
虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)，是我国最主要的养殖经济贝类之一，产自我国辽宁省和山东省。贝柱作为扇贝中最具经济价值的部位，是扇贝加工的主要产品。伴随扇贝加工业的不断发展，随之而来的问题是加工过程中产生大量的副产物。扇贝裙边是扇贝加工的副产物之一，主要是扇贝的外套膜。目前这些扇贝裙边因为其价值低，通常被丢弃，不仅造成环境的污染，也是生物资源的浪费。因此，开发利用扇贝裙边具有重要意义。免疫系统是人体抵御外来侵害的最主要防线。目前，利用天然无毒的免疫调节剂来提高人体的免疫力成为备受关注的研究课题。最常用的免疫刺激剂有左旋咪唑、脂多糖和葡聚糖等。开发效果明显、副作用小、无残留的新型免疫刺激剂成为当前尤为重要的任务。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种虾夷扇贝裙边多糖，以虾夷扇贝加工产生的裙边副产物为原料，通过酶解和色谱分离等过程制备得到一种酸性多糖成分，其含有硫酸基，由多种单糖残基构成，两条主链分别由(→4)β-GlcA(1→4)α-GlcNAc→)结构和(→4)β-GlcA(1→3)-GalNAc→)结构组成。这种酸性多糖具有提高细胞产生一氧化氮含量和提高细胞因子转录水平的免疫刺激作用。本专利技术提供了一种虾夷扇贝裙边多糖(SPYP)，其所述酸性多糖的两条主链分别由(→4)β-GlcA(1→4)α-GlcNAc→)结构和(→4)β-GlcA(1→3)-GalNAc→)结构组成；其中，所述多糖的硫酸基含量为5.73％～5.95％，糖醛酸含量为11.96％～13.84％；所述多糖的重均分子量为13.58kDa；所述多糖的单糖组成包括甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、氨基半乳糖(GalN)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)；所述虾夷扇贝裙边多糖，单糖组成的摩尔比具体为甘露糖∶氨基葡萄糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶氨基半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖∶岩藻糖＝17.7∶11.7∶12.1∶1.0∶15.9∶8.0∶23.7∶24.7。本专利技术还提供了所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，包括步骤：S1、取虾夷扇贝裙边，真空冷冻干燥，破碎成粉，得虾夷扇贝裙边干粉，所述虾夷扇贝裙边干粉为含水重量≤5％的粉末；向所述虾夷扇贝裙边干粉中加入其重量3～5倍体积的水(g/ml)，再加入所述虾夷扇贝裙边干粉重量0.5～1.5％(m/m)的胰蛋白酶干粉，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USPU/mg，37～40℃水浴震荡酶解2～4h之后加入所述虾夷扇贝裙边干粉重量1.0～1.5％(m/m)的木瓜蛋白酶干粉，所述木瓜蛋白酶干粉的酶活≥2000U/mg，50～60℃水浴震荡酶解2～4h制得混合溶液；S2、将步骤S1所述混合溶液加热灭酶，冷却至室温，调节pH＝7.0，离心取上清液；S3、向步骤S2所述上清液中加入其体积10～20％(v/v)的D204型大孔树脂，35～39℃水浴搅拌吸附5～7h后装入色谱柱中，用去离子水洗至滤出液无颜色；S4、用1.5mol/LNaCl溶液洗脱3～5倍柱体积，收集滤出液；S5、向步骤S4所述滤出液中加入其体积3～4倍的无水乙醇(v/v)，放置于4℃中静置24～36h，得悬浊液A；S6、将步骤S5所述悬浊液A一次离心取沉淀，向所述沉淀中加入其重量1～2倍体积的去离子水(g/ml)溶解沉淀，调节pH＝8.0，于50℃加热搅拌2h，静置冷却至室温后，再次离心取上清液；S7、向步骤S6所述上清液中加入步骤S1所述虾夷扇贝裙边干粉重量0.1～0.3％(m/m)的胰蛋白酶干粉，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USPU/mg，调节pH＝8.0后，于37～40℃加热搅拌4～6h，加热灭酶，再静置冷却至室温，得酶解液；S8、向步骤S7所述酶解液中加入亚硫酸氢钠作保护剂，所述亚硫酸氢钠和所述酶解液的料液比为(0.2～2)∶100g/ml，调节pH至1.5～2.0，离心脱除蛋白，收集上清液；S9、向步骤S8所述上清液中加入过氧化氢，所述过氧化氢和所述上清液的体积比(1～2)∶100，调节pH＝8.5，静置14～16h，调节pH＝6.5，加入相当于所述上清液体积3倍体积的无水乙醇，于4℃静置沉淀10～15h，得悬浊液B；S10、将步骤S9所述悬浊液B离心收集沉淀，用去离子水A溶解所述沉淀，用3500Da截留分子量的透析袋在去离子水B中透析3天后，冻干透析袋内液体至含水重量≤5％，得到虾夷扇贝裙边多糖；其中，所述沉淀和所述去离子水A的重量体积比为1∶(1～100)g/ml。优选方式下，步骤S2所述加热灭酶具体为：将步骤S1所述混合液置于沸水浴中加热10min；所述离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃。优选方式下，步骤S6所述一次离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃；所述再次离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃；使用6.0mol/LNaOH调节沉淀溶解后的pH至8.0；优选方式下，步骤S7用6.0mol/LNaOH调节pH＝8.0；所述加热灭酶的参数为100℃加热10min。优选方式下，步骤S8用HCl调节pH至1.5～2.0；所述离心的参数为：转速8000～12000r/min，时间7～20min，温度4℃。优选方式下，步骤S9用NaOH调节pH＝8.5；用HCl调节pH＝6.5。优选方式下，步骤S10所述离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃；所述冻干的参数为：冷阱温度-45～-55℃，真空度＜10Pa。如无特殊说明，本专利技术所述室温为10～38℃。优选方式下，所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，包括步骤：S1、取虾夷扇贝裙边，在冷阱温度-50℃、真空度1Pa条件下真空冷冻干燥至含水重量为1％，打粉，得虾夷扇贝裙边干粉；向1000g所述虾夷扇贝裙边干粉中加入5L水，再加入5g的胰蛋白酶干粉，37℃水浴震荡酶解3h，加入15g木瓜蛋白酶干粉，50℃水浴震荡酶解4h，得混合溶液；其中，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USPU/mg，所述木瓜蛋白酶的酶≥2000U/mgS2、将步骤S1所述混合溶液置于沸水浴加热10min灭酶，冷却至室温，使用NaOH调节pH＝7.0，4℃、转速4000r/min离心10min，收集上清液；S3、向步骤S2所述上清液中加入其体积1/10的D204型大孔树脂，37℃水浴搅拌吸附6h后将所述树脂装入色谱柱中，用去离子水洗至滤出液无颜色；S4、用4倍柱体积的1.5mol/LNaCl洗脱，收集滤出液；S5、向步骤S4所述滤出液中加入其4倍体积的无水乙醇，放置于4℃中静置24h，得悬浊液A；S6、将步骤S5所述悬浊液A置于4℃、转速4000本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种虾夷扇贝裙边多糖，其特征在于，所述多糖的两条主链由(→4)β-GlcA(1→4)α-GlcNAc→)结构和(→4)β-GlcA(1→3)-GalNAc→)结构组成；所述多糖的硫酸基含量为5.73％～5.95％，糖醛酸含量为11.96％～13.84％，重均分子量为13.58kDa；单糖组成的摩尔比为甘露糖:氨基葡萄糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:氨基半乳糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝17.7:11.7:12.1:1.0:15.9:8.0:23.7:24.7。/n

【技术特征摘要】
1.一种虾夷扇贝裙边多糖，其特征在于，所述多糖的两条主链由(→4)β-GlcA(1→4)α-GlcNAc→)结构和(→4)β-GlcA(1→3)-GalNAc→)结构组成；所述多糖的硫酸基含量为5.73％～5.95％，糖醛酸含量为11.96％～13.84％，重均分子量为13.58kDa；单糖组成的摩尔比为甘露糖:氨基葡萄糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:氨基半乳糖:葡萄糖:半乳糖:岩藻糖＝17.7:11.7:12.1:1.0:15.9:8.0:23.7:24.7。


2.一种如权利要求1所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，其特征在于，包括步骤：
S1、取虾夷扇贝裙边，真空冷冻干燥至含水重量≤5％，破碎成粉，得虾夷扇贝裙边干粉；向所述虾夷扇贝裙边干粉中加入水，再加入所述虾夷扇贝裙边干粉重量0.5％～1.5％的胰蛋白酶干粉，37～40℃水浴震荡酶解2～4h，加入所述虾夷扇贝裙边干粉重量1.0％～1.5％的木瓜蛋白酶干粉，50～60℃水浴震荡酶解2～4h，得混合溶液；其中，所述虾夷扇贝裙边干粉和水的重量体积比为1:(3～5)g/ml；所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USPU/mg，所述木瓜蛋白酶干粉的酶活≥2000U/mg；
S2、将步骤S1所述混合溶液加热灭酶，冷却至室温，调节pH＝7.0，离心取上清液；
S3、向步骤S2所述上清液中加入其体积10％～20％的D204型大孔树脂，35～39℃水浴搅拌吸附5～7h，将所述树脂装入色谱柱中，用去离子水洗至滤出液无颜色；
S4、用1.5mol/LNaCl溶液洗脱3～5倍柱体积，收集滤出液；
S5、向步骤S4所述滤出液中加入其体积3～4倍的无水乙醇，放置于4℃中静置24～36h，得悬浊液A；
S6、将步骤S5所述悬浊液A一次离心取沉淀，加入去离子水溶解所述沉淀，调节pH＝8.0，于50℃加热搅拌2h，静置冷却至室温后，再次离心取上清液；其中，所述沉淀和所述去离子水的重量体积比为1:(1～2)g/ml；
S7、向步骤S6所述上清液中加入步骤S1所述虾夷扇贝裙边干粉重量0.1％～0.3％的胰蛋白酶干粉，调节pH＝8.0，于37～40℃加热搅拌4～6h，加热灭酶，静置冷却至室温，得酶解液；其中，所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250USPU/mg；
S8、向步骤S7所述酶解液中加入亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠和所述酶解液的料液比为(0.2～2):100g/ml，调节pH至1.5～2.0，离心收集上清液；
S9、向步骤S8所述上清液中加入过氧化氢，所述过氧化氢和所述上清液的体积比(1～2):100，调节pH＝8.5，静置14～16h，调节pH＝6.5，加入所述上清液体积3倍体积的无水乙醇，于4℃静置沉淀10～15h，得悬浊液B；
S10、将步骤S9所述悬浊液B离心收集沉淀，用去离子水A溶解所述沉淀，用3500Da截留分子量的透析袋在去离子水B中透析3天后，冻干透析袋内液体至含水重量≤5％，得到虾夷扇贝裙边多糖；其中，所述沉淀和所述去离子水A的重量体积比为1:(1～100)g/ml。


3.根据权利要求2所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，其特征在于，步骤S2所述加热灭酶具体为：将步骤S1所述混合液置于沸水浴中加热10min。


4.根据权利要求2所述虾夷扇贝裙边多糖的提取方法，其特征在于，步骤S6所述一次离心的参数为：转速4000r/min，时间10min，温度4℃。


5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋爽，刘正奇，温成荣，艾春青，董秀萍，付颖寰，杨静峰，祁立波，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21