用酶组合物检测肌酸水平制造技术

本发明专利技术提供了允许灵敏测定特定溶液中肌酐水平的组合物和系统。还提供了通过优化检测肌酐的酶催法实时测定肌酐水平和肌酐清除率，从而可以实时监测肾脏功能。认为这在活体受试者的监测以及在用于移植的离体器官例如肾脏的监测中都是有用的。

Detection of creatine level with enzyme composition

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用酶组合物检测肌酸水平专利
本专利技术提供了允许灵敏测定特定溶液中肌酐水平的组合物和系统。还提供了在实时测定肌酐水平和肌酐清除率中使用该组合物和系统的方法，从而可以实时监测肾脏功能。专利技术背景尽管肾脏具有许多不同的组成部分，例如肾单位和肾小球，其功能可能会个别受损，但是目前测定受试者肾脏功能的方法评估肾脏的总体功能，目前尚无法测定肾脏的哪个精确部分受到影响。这种肾脏功能的总体测量称为肾小球滤过率(GFR)，并评估肾脏从血液中清除物质(特别是肌酐)的能力。这是临床环境中常规使用的方法。GFR通常报告为标准化为1.73m2体表面积的以ml/min为单位的值。正常的成人GFR在90ml/min/1.73m2和130ml/min/1.73m2之间。GFR恶化是评估患者慢性肾脏疾病分期的临床手段，其中GFR为15ml/min或以下时被称为晚期肾衰竭。基于肌酐清除率的GFR计算公式为GFR(ml/min)＝尿流率·([尿]/[血浆])尽管即使在肾功能下降的情况下，分泌的肌酐量仍保持恒定，但远端肾小管也会分泌少量肌酐。由于肾脏不断滤过，肌酐以微摩尔浓度存在于人血中。在稳定状态的系统中，人体的骨骼肌将向血流中释放恒定量的肌酐，肾脏将通过滤过和肾小管主动分泌的组合将其从循环系统中清除。这种肾小管主动分泌在较低的功能极限处包含较大比例的肌酐清除率，并导致高估肾小球滤过率(GFR)。在临床实践中测量肌酐目前使用三种主要技术来测量临床样本中的肌酐浓度：(i)Jaffe反应，(ii)酶法和(iii)同位素稀释质谱法(IDMS)，后者是目前所有其他方法与之所比较的方法。IDMSIDMS被认为是量化现代临床生物化学中目标分析物的最准确方法。原理很简单，类似于通过标签和释放方法估算动物的野生种群。从未知数量但已知同位素组成的样本开始，然后用已知数量和同位素组成的标准液稀释样本，就可以通过测量相关同位素的最终稀释率来测定原始样本中的浓度。该方法将内部比例归一化与现代质谱的高精度和低检测限结合在一起，从而可在低偏差的情况下获得高度准确且可重现的结果。不幸的是，进行该测定所需的方法、GC-MS设备的尺寸和成本并未使其小型化，从而无法纳入连续的在线肌酐测定中。Jaffe反应该检测肌酐的方法早于将其作为肾功能重要指标的认识。MaxJaffe(1841-1911)于1886年发表了苦味酸和尿肌酐的反应产物碱化后有色化合物生产的第一个正式描述，并为此命名了该检测方法。可以使用比色法或分光光度法以520nm的最大吸光度快速评估颜色变化的强度，从而快速评估样本中的肌酐含量。不幸的是，该方法并非没有缺点，尤其是实验室之间缺乏标准化的历史，这一点已由导致开发IDMS标准的工作证明[35]。Jaffe反应也是高度非特异性的，会与人体样本中经常发现的大量内源性和外源性化合物产生假阳性或阴性，包括微量的蛋白质、葡萄糖、酮体、胆红素和某些氨基糖苷和头孢菌素抗生素。试图针对这些进行校正实际上会给正常功能和异常功能之间的边界值带来更大的不确定性，并且自相矛盾地低估没有发现内源性干扰物的尿中肌酐浓度[37]。为了说明即使是很小的误差的影响，血清肌酐浓度绝对值仅增加20μmol也可能意味着正常功能和早期肾衰竭之间的差异。由于这些原因，在发达国家，Jaffe方法正逐渐被酶检测所取代。三酶系统该方法依赖于更复杂的三步法，即以肌酸和肌氨酸为中间物，以脲为中间副产物，将肌酐消化成1：1：1摩尔比的过氧化氢、甲醛和甘氨酸。该系统可导致两个潜在的非光学检测目标：脲和过氧化氢。检测脲脲的检测需要进一步与脲酶的偶联反应，以催化NH3和CO2的产生。尽管NH3的检测因困难而复杂，但可以使用常见的Severinghaus电极或更稀有掺杂的纳米材料来量化CO2的产生[51]。Severinghaus电极需要玻璃pH电极的特殊内部配置，该电极被封装在已知pH的NaHCO3溶液中，并通过透气膜与样本溶液隔开。当CO2穿过膜时，它溶解在NaHCO3溶液中以释放H+离子。然后在内部pH电极上用电位计传感这些。虽然原理很容易理解，并且传感器在正常人血pCO2范围内呈线性行为，但是这种三壁、含液体的传感器却很难小型化，并且在微加工的Severinghaus型电极的文献中只有少量报道，响应时间非常慢[52]。此外，从肌酐的完全消化释放出的二氧化碳量最多将在亚毫摩尔范围内。这意味着，无论是从血液还是从尿液中提取样本，任何二氧化碳传感器系统都将暴露于正常代谢过程中溶解于样本中的二氧化碳本底水平的预期信号强度的数十倍偏移(4.5-6kPa，1.75≡2.33mmol)。最后，任何生物样本中的脲水平也将远高于肌酐水平。检测H2O2H2O2是氧化代谢过程的结果，会在血液和尿液中产生，但在低微摩尔水平下，在血浆中内源性抗氧化剂(包括过氧化氢酶、血红素和抗坏血酸)的作用下迅速降低[53]。因此，在三重酶方案中，H2O2唯一可识别的来源是通过肌氨酸氧化酶的肌酐本身。H2O2也可以通过安培法轻松检测到。最后，与通过谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶检测肌酐脱亚氨酶的情况不同，三重酶系统的总体平衡与产物的产生和底物的消耗非常接近。这表明较高的产品电位水平，以及因此而产生的信号，是由较少量的底物引起的，从而改善了该系统的信噪比和检测极限。微透析微透析是一种从目标组织或溶液中获取连续的小分子样本，同时将干扰物减至最少的方法，最初是在1970年代率先从大鼠大脑中提取神经递质[55]。它的工作原理是用一种缺乏目标分子的流体连续灌注半透膜的一侧，使目标分子沿膜的浓度梯度向下扩散到灌注液中。同时，高于膜截留重量的分子或已经与灌注液平衡的分子的浓度不会改变。然后，膜后透析液将目标分子带到检测系统。微流控术语“微流控”描述了使用纳升级或以下的液体体积进行处理的实践，其流动通道的直径仅为数十至数百微米。与传统的实验室分析不同，在此类级上进行操作可带来强大的优势，可减少所需的样本量和潜在的昂贵试剂，同时提高灵敏度、可重复性和分析速度[56]。这对于基于酶的反应特别有用，在这种情况下，酶本身的成本可能特别高，而在微量透析的情况下，只有少量底物可用。Labsmith平台LabSmith微流控平台系统与内径为150μm的惰性PEEK(聚醚醚酮)管材(外径为360μm)兼容，具有定制的毫升级底物和反应物储存器，能够处理微升体积的精密微泵，可产生低至≈每秒8纳升(500nl/min)的流速，以及带有内部PEEK表面的三通或四通切换阀。所有这些组件都是完全模块化的，并且可以与用于形成防水微流控连接的通用锁紧卡套配件和用于将其他各个组件固定在适当位置的螺丝固定式线路板系统互换。安培传感器安培法是一种在一定电势下测量氧化还原反应消耗或产生的电子数的技术，例如LeylandClark(1918-2005)在1950年代专利技术的用于在-0.6V至-0.7V本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种传感器系统，其包含肌氨酸氧化酶和/或肌酐酶和/或肌酸酶和至少第一传感器，可选地为安培传感器，可选地，其中肌氨酸氧化酶和/或肌酐酶和/或肌酸酶是组合物的一部分。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170804 GB 1712592.31.一种传感器系统，其包含肌氨酸氧化酶和/或肌酐酶和/或肌酸酶和至少第一传感器，可选地为安培传感器，可选地，其中肌氨酸氧化酶和/或肌酐酶和/或肌酸酶是组合物的一部分。


2.根据权利要求1所述的传感器系统，其中所述组合物包含肌氨酸氧化酶、肌酐酶和肌酸酶中的任意两种或全部。


3.根据权利要求1或2中任一项所述的传感器系统，其包含肌氨酸氧化酶、肌酐酶和肌酸酶。


4.根据权利要求2或3所述的传感器系统，其中至少一种，任选地两种，任选地所有的酶未固定化，任选地，其中所有的酶都在溶液中。


5.根据权利要求4所述的传感器系统，其中所述肌氨酸氧化酶、肌酐酶和肌酸酶在溶液中。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的传感器系统，还包含缓冲液，可选地，其中所述组合物包含缓冲液。


7.根据权利要求6所述的传感器系统，其中所述缓冲液不是磷酸盐缓冲液或PBS，和/或不是Tris缓冲液，和/或不是四硼酸盐和/或不是HEPES。


8.根据权利要求6或7中任一项所述的传感器系统，其中所述缓冲液选自EPPS、HEPBS、POPSO、HEPPSO和MOBS。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的传感器系统，其中所述组合物或缓冲液的pH在7.0-9.0之间，任选地在7.3-8.95之间，任选地为8.5。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的传感器系统，其中，所述组合物包含pH8.0-8.5的EPPS，任选地pH8.0-8.5的50mMEPPS，任选地pH8.0的50mMEPPS或pH8.5的50mMEPPS。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的传感器系统，其中所述组合物还包含脲酶和/或尿酸酶和/或检测胱抑素C的工具和/或检测白蛋白的工具。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的传感器系统，其中所述肌酐酶得自Sorachim目录号CNH-311；和/或肌酸酶得自Sorachim目录号CRH-211；和/或肌氨酸氧化酶得自Sorachim目录号SAO-351。


13.根据权利要求1-12中任一项所述的传感器系统，其中所述组合物中的肌氨酸氧化酶和/或肌酐酶和/或肌酸酶的浓度使得在最终反应混合物中肌酐酶的浓度为至少300U/ml，和/或肌酸酶的浓度为至少120U/ml，肌氨酸氧化酶的浓度为至少10U/ml。


14.根据权利要求1-13中任一项所述的传感器系统，其中所述组合物使得由含有肌酐的样本与前述权利要求中任一项的组合物混合而产生的最终混合溶液包含比率为10:5:1至49:8:1U/ml的肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶。


15.根据权利要求1-13中任一项所述的传感器系统，其中所述组合物使得由含有肌酐的样本与前述权利要求中任一项的组合物混合而产生的最终混合溶液包含量为600U/ml、300U/ml和60U/ml的肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶，任选地，其中组合物的pH为8.5。


16.根据权利要求1-15中任一项所述的传感器系统，包括微流控电路、微流控装置和微透析探针中的任一种。


17.根据权利要求1-16中任一项所述的传感器系统，还包括连续流系统。


18.根据权利要求1-17中任一项所述的传感器系统，其中所述系统还包括：采集样本、任选地取自患者的样本，或者取自闭环离体灌注器官，任选地肾脏的样本的工具。
任选地，其中取自患者的样本是微透析液，任选地取自血液、尿液、血浆、组织液、脑脊髓液。


19.根据前述权利要求中任一项所述的传感器系统，其布置为使得在使样本与传感器接触之前，将肌氨酸氧化酶和/或肌酐酶和/或肌酸酶或根据前述权利要求中任一项的组合物添加到样本中，任选地，其中在与传感器接触之前，添加传感试剂大于1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250秒，5、5.5、6、6.5、7.5、8、8.5、9、9.5或10分钟。


20.根据前述权利要求中任一项所述的传感器系统，其中所述系统包括在添加所述传感试剂之前或之后增加样本中氧量的装置，任选地，其中所述增加氧量的装置选自以下的一个或多个：
混合器，其任选地包括导流板或蛇形区域，任选地，其中所述混合器由高渗透性材料例如PDMS制成；
通过聚四氟乙烯管连接的多个混合段；
加压容器。


21.根据前述权利要求中任一项所述的传感器系统，其中所述系统可以检测浓度小于10uM，任选地小于7.5uM，任选地小于5uM，任选地小于4uM，任选地小于3uM，任选地小于2uM，任选地小于1uM的肌酐。


22.根据前述权利要求中任一项所述的传感器系统，其中所述传感器系统可以相对于40uM至120uM的本底肌酐水平检测小于1uM，或小于2uM或小于3uM或小于4uM，或小于5uM或小于7.5uM或小于10uM的肌酐浓度变化。


23.根据前述权利要求中任一项所述的传感器系统，其中所述系统包括用于从传感器收集数据的装置，任选地为PowerLab/4SP，任选地，其中所述系统还包括用于发送所述数据的无线发送装置。


24.根据前述权利要求中任一项所述的传感器系统，其中所述系统还包括用于数据分析的装置，任选地为计算机或可穿戴设备，任选地，其中所述用于数据分析的装置包括用于接收无线发送的数据的装置。


25.根据前述权利要求中任一项所述的传感器系统，还包括至少一个废物收集容器，可选地，其中废物收集容器的体积小于10ml，例如小于9.5ml，例如小于9ml，例如小于8.5ml，例如小于8ml，例如小于7.5ml，例如小于7ml，例如小于6.5ml，例如小于6ml，例如小于5.5ml，例如小于5ml，例如小于4.5ml，例如小于4ml，例如小于3.5ml，例如小于3ml，例如小于2.5ml，例如小于2ml，例如小于1.5ml，例如小于1ml，例如小于0.5ml，例如小于0.25ml。


26.根据前述权利要求中任一项所述的传感器系统，其中所述系统是移动的系统。


27.根据前述权利要求中任一项所述的传感器系统，其中所述系统包括计算肌酐水平/肌酸酐清除率/肾小球滤过率的装置。


28.根据前述权利要求中任一项所述的传感器系统，进一步包括递送试剂，任选地造影剂或药物或肌酐，或肌酸或肌氨酸的装置，任选地，其中所述装置是药物泵，
任选地，其中所述药物选自免疫抑制剂；化学治疗剂，例如铂剂；抗菌素，例如糖肽万古霉素和替考拉宁，以及青霉素；阿片类镇痛药，例如吗啡、海洛因和可待因；
任选地，其中基于所计算的肌酐水平/肌酐清除率/肾小球滤过率来调节所递送的试剂的量。


29.根据前述权利要求中任一项所述的传...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁·G·鲍特尔，罗伯特·M·李尔尼，
申请(专利权)人：IP二IPO创新公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB