泛素连接酶RNF38作为鼻咽癌标志物的应用制造技术

本发明专利技术提供泛素连接酶RNF38作为鼻咽癌标志物的应用，属于生物监测领域。本申请通过基础实验证明RNF38与鼻咽癌转移显著相关，并通过免疫组化的方法检测RNF38的表达，方法简单、便利，成本低，可行性及重复性高，在一定程度上预测鼻咽癌患者的转移，从而筛选鼻咽癌高转移的人群，辅助鼻咽癌的临床诊疗。

Application of ubiquitin ligase rnf38 as a marker of nasopharyngeal carcinoma

【技术实现步骤摘要】
泛素连接酶RNF38作为鼻咽癌标志物的应用
本专利技术属于检测领域，具体涉及泛素连接酶RNF38作为鼻咽癌标志物的应用，通过检测鼻咽癌组织中RNF38的表达辅助鼻咽癌患者的预后预测和临床诊疗。
技术介绍
鼻咽癌是我国南方最常见的恶性肿瘤之一，目前鼻咽癌的5年生存率可高达80%以上。然而，超过70%的患者就诊时即为中晚期，患者生存时间短，预后差。因此，寻找潜在的预测鼻咽癌转移的靶点，筛选鼻咽癌的高危人群，对于辅助鼻咽癌患者的诊疗有重要的意义。目前临床主要根据TNM分期来预测鼻咽癌远处转移。然而，TNM分期的最大问题是只有考虑肿瘤的侵犯范围，而没有考虑肿瘤的生物学行为和肿瘤的异质性，单纯依靠TNM分期不能准确的区分患者的转移风险，可导致治疗不足或者治疗过度。泛素化修饰与肿瘤的发生发展密切相关，泛素化修饰异常是致癌的重要因素。泛素-蛋白酶体系统，包括泛素激活酶、泛素结合酶和泛素连接酶等，介导真核生物体内80%~85%的蛋白质降解。其中，泛素连接酶是介导泛素化修饰的泛素-蛋白酶体系统中含量最丰富的一类，可以直接决定蛋白质的活性及定位，参与肿瘤的各种生物学行为，是目前肿瘤研究的热点。RNF38是泛素连接酶之一，既往研究发现细胞和小鼠实验显示RNF38促进胃癌、非小细胞肺癌细胞的增殖；RNF38促进肝癌细胞和非小细胞肺癌细胞转移；同时，RNF38表达和肿瘤患者的预后显著相关。因此提示，RNF38与肿瘤的发生发展密切相关，可为预测鼻咽癌预后、临床诊疗及研发靶向药物提供新的理论依据，具有重要的意义。
技术实现思路
>本专利技术的目的在于提供泛素连接酶RNF38作为鼻咽癌标志物的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：泛素连接酶RNF38在制备检测鼻咽癌试剂中的应用。泛素连接酶RNF38在制备鼻咽癌辅助诊断及预后预测试剂中的应用。通过收集病理确诊鼻咽癌患者和健康人的鼻咽石蜡包块，经过免疫组织化学方法检测RNF38的表达，分析RNF38在鼻咽癌组织与正常鼻咽组织的表达规律；同时，结合患者的临床和预后信息，分析RNF38与鼻咽癌患者预后的相关性。构建RNF38过表达的稳转细胞株及RNF38沉默的稳转细胞株，通过划痕实验、细胞侵袭和细胞迁移实验，在细胞水平探讨RNF38对鼻咽癌细胞转移能力的影响；构建裸鼠尾静脉转移模型，探讨RNF38对于鼻咽癌细胞在裸鼠体内转移能力的影响。本专利技术的优点在于：泛素连接酶RNF38在鼻咽癌中临床意义目前尚未明确，本申请通过基础实验证明RNF38与鼻咽癌转移显著相关，并通过免疫组化的方法检测RNF38的表达，方法简单、便利，成本低，可行性及重复性高，在一定程度上预测鼻咽癌患者的转移，从而筛选鼻咽癌高转移的人群，辅助鼻咽癌的临床诊疗。附图说明图1为免疫组化中RNF38表达情况。图2为RNF38表达水平对鼻咽癌预后的影响。图3为RNF38的体内外划痕实验结果。图4为RNF38的侵袭和转移实验结果。图5为RNF38的裸鼠尾静脉转移结果。具体实施方式实施例1一、实验方法1.病人组织及资料收集分别收集在经病理确诊鼻咽癌患者和健康人的鼻咽石蜡包块；收集全部患者治疗前的基本临床信息，包括性别、年龄、病理类型、ECOG评分、T分期、N分期、M分期、血浆EBVDNA水平等；治疗相关信息，包括放疗剂量、化疗方案等；以及治疗后随访信息，包括总生存时间、无远处转移生存时间、无局部复发生存时间等，建成数据库为以后进行分析。免疫组织化学染色具体步骤（S-P法）每张4mm的石蜡切片滴加3.0％H2O2溶液，于室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3×3min；切片中分别加入RNF38抗体、l：50浓度稀释的RNF38抗体，37℃下分别孵育60min，后PBS冲洗3×3min；每张切片滴加50.0ul第二抗体，室温下孵育30min，PBS冲洗3×3min；每张切片滴加50.0ul的链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温下孵育30min，PBS冲洗3×3min；每张切片上滴加100.0ul新鲜配制的DAB显色液(3,3’二氨基联苯胺盐酸盐)，显微镜下观察3-5min；自来水下充分冲洗，苏木素复染，0.1％盐酸酒精分化，PBS冲洗返蓝；梯度酒精脱水干燥，继而二甲苯透明，中性树胶封片；以已知的睾丸组织作为阳性对照，以同源性匹配的IgG抗体代替一抗染色NPC组织作为阴性对照；显微镜100×，200×分别照像。免疫组织化学染色结果判断标准判读标准如下：RNF38主要表达在细胞核上，RNF38的表达由染色强度和阳性细胞决定：染色强度分级为0分(无)、1分(弱)、2分(中)、3分(强)；阳性细胞百分比分别为0分(0%)、1分(<25%)、2分(25%~50%)、3分(50%~75%)和4分(>75%)。将染色强度得分和染色阳性细胞的百分比得分相乘，并将平均得分作为判断RNF38阳性的临界值，小于该临界值的为RNF38表达阴性；反之则为阳性。的表达和临床意义的分析根据RNF38的表达，结合患者的临床和预后信息，利用SPSS20.0和Graphpad进行分析和作图。过表达和下调细胞株的建立和验证6.1细胞株的转染和构建：从上海吉凯基因有限公司购买RNF38过表达和下调慢病毒，按照操作说明书转染SUNE-1、CNE-2、6-10B，观察鼻咽癌细胞的荧光，并利用抗生素抗性进行筛选，扩大培养以备鉴定和冻存。检测RNF38的表达：收集对数生长期细胞，裂解液裂解并收集上清，Bradford方法进行蛋白定量，加入上样缓冲液后煮沸样品5min以变性，行SDS-PAGE电泳，蛋白上样量为50-100μg，半干法进行电转移，10%脱脂奶粉封闭2h，加一抗，4℃孵育过夜，TTBS洗膜3次，每次5min，加HRP标记的相应二抗，室温孵育2h，暗室ECL显影，结果扫描，以GAPDH为内参照。7.RNF38的功能学实验7.1划痕实验：空载对照和实验组细胞株接种在6孔板中，各设三个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中使其形成单层贴壁细胞。无血清培养液培养24h后，弃去培养液，利用200ul塑料枪头划出均匀的划痕；无血清培养液洗去漂浮的细胞或碎片；重新加入2ml/孔培养液。显微镜下观察并测量细胞划痕0h、12h或24h愈合情况和划痕宽度。7.2侵袭和转移实验：取10μl纤连蛋白（1mg/ml）均匀涂抹在Transwell小室（不铺Matrigel胶）和Invasion小室（铺Matrigel胶）的底膜上，将处于对数生长期的100μl细胞悬液（含2.5×105个细胞）加至小室的上室中，下室加入600μl含20%FBS的1640培养液，各设三个复孔。孵育24h后，取出Transwell和Invasion小室，用棉签轻轻擦去膜上面未迁移的细胞，PBS浸洗两遍，滤膜用甲醇固定30min，自然晾干后，在24孔板中加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.泛素连接酶RNF38在制备检测鼻咽癌试剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.泛素连接酶RNF38在制备检测鼻咽癌试剂中的应用。

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【专利技术属性】
技术研发人员：林城，潘建基，宗井凤，郭巧娟，林少俊，李梅芳，林娜，林灿阳，
申请(专利权)人：福建省肿瘤医院福建省肿瘤研究所，福建省癌症防治中心，
类型：发明
国别省市：福建;35