一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法技术

本发明专利技术属中药成分检测技术领域，提供一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法，分别制备供试品溶液、对照品溶液、混合标准品溶液，超高效液相色谱串联质谱检测混合标准品溶液，绘制标准曲线和供试品溶液，用超高效液相色谱串联质谱进行质谱正、负离子模式分析，根据标准曲线得供试品防己黄芪汤中十九种成分含量。该方法灵敏度高、重现性好，分析准确可靠，可同时定量检测防己黄芪汤中19种化学成分：芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ。

Determination of 19 components in Fangji Huangqi Decoction by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

【技术实现步骤摘要】
一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法
本专利技术属于中药成分检测
，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法。
技术介绍
防己黄芪汤始载于《金匮要略》，全方由防己、黄芪、白术、甘草、生姜、大枣组成，具有固表益气、祛风利湿等功效。近年来关于防己黄芪汤在临床上的应用主要集中于慢性心衰、心源性水肿、类风湿关节炎、慢性肾小球肾炎、肾病综合征等疾病，确切的利水药理作用使得防己黄芪汤近年来越来越受到关注。然而，现有的研究多集中在临床以及药理作用上，对其化学成分的研究较少。为了更好地研究防己黄芪汤，保证其生产质量和临床应用，急需提供对防己黄芪汤化学成分分析的方法。中药药效作用的发挥有赖于其所含的化学成分，且化学成分含量的高低和稳定性直接影响了其药效作用的强弱。中药作为一个整体，强调的是各味药的协同作用。中药中单一有效成分或指标成分控制，难以真正控制药品质量，而采用多指标多成分的含量测定方法将成为中药未来质量控制的方法的主流。随着现代分析技术的发展，超高效液相色谱串联质谱由于其分离速度快，超高灵敏度，测定专属性强而被广泛运用于中药及复方制剂的分析中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法，该方法灵敏度高、重现性好，分析准确、可靠，可满足同时定量检测防己黄芪汤中十九种化学成分（芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ）。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)供试品溶液的制备：精密称取防己黄芪汤冻干粉末35mg、300mg各一份分别于离心管中，分别加入甲醇1mL，涡旋1min混匀，控制超声温度：30℃，频率：30KHz超声处理30min，13000r/min的条件下离心15min，取上清，即得供试品溶液1号和2号，分别用于超高效液相色谱串联质谱正、负离子模式分析；（2）对照品溶液的制备：取芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ对照品精密称定，分别置5mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成浓度分别为0.624mg/mL、0.576mg/mL、0.432mg/mL、0.683mg/mL、0.462mg/mL、0.326mg/mL、0.722mg/mL、0.428mg/mL、0886mg/mL、0.550mg/mL、0.438mg/mL、0.440mg/mL、0.434mg/mL、0.642mg/mL、0.580mg/mL、1.100mg/mL、0.980mg/mL、0.500mg/mL和0.600mg/mL的对照品溶液；（3）混合标准品溶液的制备：分别吸取适量体积的十九种成分的对照品溶液于两个5mL容量瓶中，定容，得到白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、甘草素、芒柄花素、毛蕊异黄酮、紫檀烷、异黄烷、甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷苷、粉防己碱和防己诺啉碱组成的终浓度为15.19μg/mL、30.49μg/mL、21.4μg/mL、6.48μg/mL、10.26μg/mL、4.62μg/mL、9.025μg/mL、151.3μg/mL、54.6μg/mL、59.76μg/mL、29.34μg/mL、82.12μg/mL和82.5μg/mL的混合标准品溶液A；异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ和甘草次酸组成的终浓度为23.2μg/mL、198.00μg/mL、137.2μg/mL、40μg/ml、18μg/ml和16.5μg/mL的混合标准品溶液B；(4)标准曲线的绘制：将混合标准品溶液A稀释至终浓度为100％、75％、50％、30％、10％、2％的系列浓度，将混合标准品溶液B稀释至终浓度为60%、40%、20%、7%、5%、2%的系列浓度；采用超高效液相色谱串联质谱检测，其中混合标准品溶液A在正离子模式下分析，混合标准品溶液B在负离子模式下分析，并分别绘制标准曲线；所述液相色谱条件：色谱柱：WatersACQUITYUPLCHSST3液相色谱柱，规格：2.1mm×100mm，1.8μm；柱温：30℃；流动相：乙腈和0.1％甲酸水溶液；分析时间正离子为23min；负离子为17min；所述质谱条件：采用MRM多反应监测模式、ESI离子源，离子源温度400℃，质量范围：M/Z50-1500，喷雾电压：3.5千伏(+)、3.5千伏(－)，鞘气体体积：35，辅助体积：10，毛细管温度：320℃，透镜电压：55千帕，质量分辨率：70000；(5)取步骤(1)配置的1号和2号供试品溶液，采用步骤(4)中所述液相色谱条件和质谱条件，进行质谱正、负离子模式分析，再根据标准曲线即得到供试品防己黄芪汤中十九种成分含量。本专利技术优化流动相时，比较了有机相(甲醇、乙腈、0.1％甲酸甲醇和0.1％甲酸乙腈)和水相(水和0.1％甲酸水)，最终发现乙腈、0.1％甲酸水为流动相系统进行梯度洗脱时，色谱峰分离度和峰形良好，且保留时间大大缩短，该流动相系统提高了实验效率，同时也节约了试剂，具有重要经济意义。提取溶剂选择上考察了甲醇、50％甲醇和80％甲醇溶液，最终发现纯甲醇溶液能有效的提取出防己黄芪汤中19种成分，因此提取溶剂采用甲醇溶液。本专利技术与现有技术相比具有如下优点和效果：样本前处理简单、快捷，重现性好；分析时间短，不超22分钟；分离度较好，可准确测定十九种成分的含量。该方法可用于防己黄芪汤的生产质量监控。附图说明图1为样品溶液的质谱总离子流图(A：正离子；B：负离子)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细、完整的说明。实施例中使用到的仪器和试剂如下：仪器：Agilent1290超高效液相色谱仪(Agilent公司)，3200QTrap质谱仪(ABSciex公司)超声波清洗器(KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司)，色谱柱WatersACQUITYUPLCHSST3(2.1mm×100mm，1.8μm)。试剂：乙腈(质谱纯，Fisher公司)、甲醇(色谱纯，Fisher公司)、超纯水、甲酸(色谱纯，Fisher公司)，其余试剂均为分析纯。（1）供试品溶液的制备：精密称取防己黄芪汤冻干粉末35mg、300mg各一份于离心管中，加入甲醇1mL，涡旋1min混匀，进行超声处理30min（温度：30℃，频率：30KHz），13000r/min的条件下离心15min，取上清，即得供试品溶液1号和2号，分别用于超高效液相色谱串联质谱正、负离子模式分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法，其特征在于：具体步骤如下：/n（1）供试品溶液的制备：精密称取防己黄芪汤冻干粉末35mg、300mg各一份分别于离心管中，分别加入甲醇1mL，涡旋1min混匀，控制超声温度30℃，频率30KHz超声处理30min，13000r/min的条件下离心15min，取上清，即得供试品溶液1 号和2号，分别用于超高效液相色谱串联质谱正、负离子模式分析；/n（2）对照品溶液的制备：取芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ对照品精密称定，分别置5mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成浓度分别为0.624mg/mL、0.576mg/mL、0.432mg/mL、0.683mg/mL、0.462mg/mL、0.326mg/mL、0.722mg/mL、0.428mg/mL、0886mg/mL、0.550mg/mL、0.438mg/mL、0.440mg/mL、0.434mg/mL、0.642mg/mL、0.580mg/mL、1.100mg/mL、0.980mg/mL、0.500mg/mL和0.600mg/mL的对照品溶液；/n（3）混合标准品溶液的制备：分别吸取适量体积的十九种成分的对照品溶液于两个5mL容量瓶中，定容，得到白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、甘草素、芒柄花素、毛蕊异黄酮、紫檀烷、异黄烷、甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷苷、粉防己碱和防己诺啉碱组成的终浓度为15.19μg/mL、30.49μg/mL、21.4μg/mL、6.48μg/mL、10.26μg/mL、4.62μg/mL、9.025μg/mL、151.3μg/mL、54.6μg/mL、59.76μg/mL、29.34μg/mL、82.12μg/mL和82.5μg/mL的混合标准品溶液A；异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ和甘草次酸组成的终浓度为23.2μg/mL、198.00μg/mL、137.2μg/mL、40μg/ml、18μg/ml和16.5μg/mL的混合标准品溶液B；/n(4)标准曲线的绘制：将混合标准品溶液A稀释至终浓度为100％、 75％、 50％、 30％、10％、 2％的系列浓度，将混合标准品溶液B稀释至终浓度为60%、40%、20%、7%、5%、2%的系列浓度；采用超高效液相色谱串联质谱检测，其中混合标准品溶液A在正离子模式下分析，混合标准品溶液B在负离子模式下分析，并分别绘制标准曲线；/n(5)取步骤(1)配置的1号和2号供试品溶液，采用步骤(4)中所述液相色谱条件和质谱条件，进行质谱正、负离子模式分析，再根据标准曲线即得到供试品防己黄芪汤中十九种成分含量。/n...

【技术特征摘要】
1.一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）供试品溶液的制备：精密称取防己黄芪汤冻干粉末35mg、300mg各一份分别于离心管中，分别加入甲醇1mL，涡旋1min混匀，控制超声温度30℃，频率30KHz超声处理30min，13000r/min的条件下离心15min，取上清，即得供试品溶液1号和2号，分别用于超高效液相色谱串联质谱正、负离子模式分析；
（2）对照品溶液的制备：取芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ对照品精密称定，分别置5mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成浓度分别为0.624mg/mL、0.576mg/mL、0.432mg/mL、0.683mg/mL、0.462mg/mL、0.326mg/mL、0.722mg/mL、0.428mg/mL、0886mg/mL、0.550mg/mL、0.438mg/mL、0.440mg/mL、0.434mg/mL、0.642mg/mL、0.580mg/mL、1.100mg/mL、0.980mg/mL、0.500mg/mL和0.600mg/mL的对照品溶液；
（3）混合标准品溶液的制备：分别吸取适量体积的十九种成分的对照品溶液于两个5mL容量瓶中，定容，得到白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、甘草素、芒柄花素、毛蕊异黄酮、紫檀烷、异黄烷、甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷苷、粉防己碱和防己诺啉碱组成的终浓度为15.19μg/mL、30.49μg/mL、21.4μg/mL、6.48μg/mL、10.26μg/mL、4.6...

【专利技术属性】
技术研发人员：李爱平，杨柳，秦雪梅，张丽增，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14