一种粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法技术

本发明专利技术涉及一种粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法，所述粉虱类昆虫成虫显微注射采用玻璃微量注射针在显微平台进行注射，包括以下步骤：制备玻璃微量注射针；注射前虫体麻醉；把麻醉后的虫体摆放于注射专用昆虫固定培养基平板的V型槽内，进行显微注射；将注射后的虫体放入叶片饲养培养皿中饲养培养基的上面，放在光照培养箱内饲养10‑14小时后，将叶片饲养培养皿倒置，使叶正面朝上，继续饲养；本方法显微注射粉虱类昆虫的操作环节科学合理，显著提高了注射效率，减小试验误差，每小时可注射粉虱成虫80只、飞虱成虫40只，对比常规注射方法提高约3‑4倍注射速度；大大减少了注射后昆虫的死亡率，减小试验误差。

A microinjection method for the adult of Bemisia

【技术实现步骤摘要】
一种粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法
本专利技术涉及昆虫学领域，具体是涉及一种粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法。
技术介绍
显微注射技术是当前生命科学领域应用广泛的实用型技术，主要应用于微生物学、医学、昆虫学等研究领域。显微注射技术是通过显微镜观察，使用注射针将溶液注射入动植物、微生物内的操作技术。显微注射技术广泛地用于小型昆虫的成虫或若虫以及很多虫卵的注射。显微注射技术操作复杂，尤其对于小型昆虫而言，操作要求高。目前各研究机构所公开的显微注射技术多为针对细胞或大中型动植物，没有专门用于粉虱类昆虫成虫或其它小型昆虫成虫的显微注射技术。小型昆虫，如粉虱、飞虱、寄生蜂、部分虫卵或若虫等，在研究昆虫基因的功能和昆虫共生菌的功能时，需要注射双链RNA、小干扰RNA、抗生素、小向导RNA、蛋白、化合物等进行活体研究，在研究过程中对注射虫体的数量和成活率具有严格的要求。例如基因干扰试验研究，尤其是在同一时间段注射不同处理的虫体，从而减小误差，注射后要求虫体成活较长的时间，目前的注射方法和注射虫体饲养方法不能满足需求。
技术实现思路
为了弥补上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提出一种粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法，显微注射粉虱类昆虫的操作环节科学合理，显著提高了注射效率，大大减少了注射后昆虫的死亡率，减小试验误差，为小型昆虫研究领域提供有效技术方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的，一种粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法，所述粉虱类昆虫成虫显微注射采用玻璃微量注射针在显微平台进行注射，所述显微平台包括体视显微镜，气泵注射系统，显微操纵架，拉针仪，磨针仪，防震台，其技术要点为：所述粉虱类昆虫成虫显微注射包括以下步骤：（1）制备玻璃微量注射针：所述玻璃微量注射针内径为4.5-5.5μm，所述玻璃微量注射针的针尖长度为5.5-6.5mm，注射针的长度为4-4.5cm；（2）注射前虫体麻醉：将待注射的虫体进行冰上麻醉，烟粉虱麻醉时间为20-40分钟、温室白粉虱麻醉时间为50-70分钟、褐飞虱麻醉时间4-6分钟、灰飞虱麻醉时间10-15分钟；（3）显微注射：将冰盒固定在显微镜底座移动平台上，将固定培养基放在冰盒上用小毛刷把麻醉后的虫体摆放于注射专用昆虫固定培养基平板的V型槽内，进行显微注射；所述注射专用昆虫固定培养基配方为4%的琼脂凝胶+0.04%复配着色剂；所述复配着色剂为天蓝色或果绿色任一种；所述注射专用昆虫固定培养基平板上设有一至三条V型槽，所述V型槽宽0.5-1mm，槽深0.5-1mm；（4）注射后饲养：将注射后的虫体用小毛刷挑出，放入叶片饲养培养皿中饲养培养基的上面，用封口膜封口，放在光照培养箱内饲养10-14小时后，将叶片饲养培养皿倒置，使叶正面朝上，继续饲养；所述叶片饲养培养皿的培养皿盖设有一个直径为2-4cm的孔洞，所述孔洞外覆盖100目纱网；所述饲养培养基配方为1.5%琼脂培养基+1%PBS溶液，所述饲养培养基上铺设有番茄、棉花或烟草的幼嫩叶片，将叶片按叶背面朝上铺满培养皿并压实；将带有制作好的叶片饲养培养皿置于27℃光照培养箱中倒置12h后使用；进一步的，所述拉针仪参数为HEAT：265，FIL：3，VEL：30，DEL：225，PUL：150。进一步的，所述磨针仪的磨针角度45°。本专利技术的有益效果：（1）本方法显微注射粉虱类昆虫的操作环节科学合理，显著提高了注射效率，减小试验误差，每小时可注射粉虱成虫达80只、飞虱成虫达40只，对比常规注射方法提高约3-4倍注射速度。（2）本方法大大减少了注射后昆虫的死亡率，操作简单，可应用生物种类多，为小型昆虫分子生物学研究领域提供有效技术方法。附图说明图1为培养皿中V型槽排列图；图2为培养基中V型槽截面图；图1-图2中，各结构名称为：培养皿1，培养基2，V型槽3。具体实施方式实施例1粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法注射对象：烟粉虱、温室白粉虱、褐飞虱、灰飞虱。注射方法：（1）调整显微平台：揭开显微镜、磨针仪防尘罩，摘下镜头盖；打开光源；打开气泵开关，确认平衡压力（pc）已调至0；所述显微注射平台包括：Olympus体视显微镜、eppendorf气泵注射系统、日本成茂显微操纵架、Sutter拉针仪及磨针仪、连胜品牌防震台；（2）将冰盒固定在显微镜底座移动平台上，放入一个14.5×10×2cm冰盒，将固定培养基放在冰盒上；将显微操纵架调整至与水平成45°夹角；（3）注射针制作方式：注射针使用玻璃（或石英）毛细管，用拉针仪拉制而成；注射针尖端原则上要求足够尖锐且不易弯曲、具备足够刚度；当使用SUTTERP-2000拉针仪，拉制WPI标准硅硼酸盐玻璃毛细管时，拉制好的针尖长度约为0.5厘米；拉针仪参数调制：HEAT：265，FIL：3，VEL：30，DEL：225，PUL：150；注射针拉好后，应密集排列于粘有双面胶带的培养皿上，切勿触碰针尖造成注射针损坏；（4）注射针磨针开口，使用SutterBV-10磨针仪，磨针角度45°，在磨盘边缘均匀地滴加蒸馏水，将针尖搭在磨盘边缘蒸馏水中，调节微调旋钮进行磨针，当蒸馏水吸入注射针时，即表示针已开口，在磨针前及磨针后均需要对磨盘进行清洗；（5）用Eppendorfmicroloader进样针吸取待注射液体，加入到注射针内，将注射针插入注射杆头部，拧紧；将注射杆的导气管尾部卡扣卡在气泵接口上；（6）调节气泵参数、显微操纵杆位置、注射针位置及角度；踩下压力板，或通过气泵上的“inject”“clean”按钮观察是否已开针；（7）将待注射的虫子进行冰上麻醉，烟粉虱麻醉时间为30分钟、温室白粉虱麻醉时间为1小时、褐飞虱麻醉时间5分钟、灰飞虱麻醉时间10-15分钟。用小毛刷轻轻摆放于注射专用昆虫固定培养基平板的V型槽内，进行注射；见图1-图2，所述述注射专用昆虫固定培养基配方为4%的琼脂凝胶+0.04%复配着色剂（Americolor天蓝色可食用型复配着色剂）；所述注射专用昆虫固定培养基平板内设有1至3条V型槽，所述V型槽宽0.5-1mm，槽深0.5-1mm，用V型截面的长塑料条漂浮于未凝固的培养基上，待培养基凝固后，取出塑料条制得；（8）将注射后的虫体用小毛刷挑出，放在叶片饲养培养皿中饲养培养基的上面，用封口膜封口，放在光照培养箱内饲养10-14小时后，将叶片饲养培养皿倒置，使叶正面朝上，继续饲养；所述叶片饲养培养皿为塑料培养皿，规格为直径3.5cm，叶片饲养培养皿的培养皿盖设有1个直径为2cm的孔洞，所述孔洞外覆盖100目纱网；所述饲养培养基配方为1.5%琼脂培养基+1%PBS溶液，饲养培养基的高度为2-7mm，即依据培养皿使用天数确定培养基用量；所述饲养培养基上设有番茄棉花或烟草的幼嫩叶片，将叶片按叶背面朝上铺满培养皿并压实；将带有制作好的叶片饲养培养皿置于27℃光照培养箱中倒置12h。采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法，所述粉虱类昆虫成虫显微注射采用玻璃微量注射针在显微平台进行注射，所述显微平台包括体视显微镜，气泵注射系统，显微操纵架，拉针仪，磨针仪，防震台，其特征为：所述粉虱类昆虫成虫显微注射包括以下步骤：/n（1）制备玻璃微量注射针：所述玻璃微量注射针内径为4.5-5.5μm，所述玻璃微量注射针的针尖长度为5.5-6.5mm；/n（2）注射前虫体麻醉：将待注射的虫体进行冰上麻醉；/n（3）显微注射：将冰盒固定在显微镜底座移动平台上，将固定培养基放在冰盒上，把麻醉后的虫体摆放于注射专用昆虫固定培养基平板的V型槽内，进行显微注射；/n所述述注射专用昆虫固定培养基配方为4%的琼脂凝胶+0.04%复配着色剂；所述复配着色剂为天蓝色或果绿色任一种；所述注射专用昆虫固定培养基平板上设有一至三条V型槽，所述V型槽宽0.5-1mm，槽深0.5-1mm；/n（4）注射后饲养：将注射后的虫体放入叶片饲养培养皿中饲养培养基的上面，用封口膜封口，放在光照培养箱内饲养10-14小时后，将叶片饲养培养皿倒置，使叶正面朝上，继续饲养；/n所述叶片饲养培养皿的培养皿盖设有一个直径为2-4cm的孔洞，所述孔洞外覆盖100目纱网；所述饲养培养基配方为1.5%琼脂培养基+1%PBS溶液，所述饲养培养基上铺设有番茄、棉花或烟草任一种的幼嫩叶片，将叶片按叶背面朝上铺满培养皿并压实；将带有制作好的叶片饲养培养皿置于27℃光照培养箱中倒置12h后使用。/n...

【技术特征摘要】
1.一种粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法，所述粉虱类昆虫成虫显微注射采用玻璃微量注射针在显微平台进行注射，所述显微平台包括体视显微镜，气泵注射系统，显微操纵架，拉针仪，磨针仪，防震台，其特征为：所述粉虱类昆虫成虫显微注射包括以下步骤：
（1）制备玻璃微量注射针：所述玻璃微量注射针内径为4.5-5.5μm，所述玻璃微量注射针的针尖长度为5.5-6.5mm；
（2）注射前虫体麻醉：将待注射的虫体进行冰上麻醉；
（3）显微注射：将冰盒固定在显微镜底座移动平台上，将固定培养基放在冰盒上，把麻醉后的虫体摆放于注射专用昆虫固定培养基平板的V型槽内，进行显微注射；
所述述注射专用昆虫固定培养基配方为4%的琼脂凝胶+0.04%复配着色剂；所述复配着色剂为天蓝色或果绿色任一种；所述注射专用昆虫固定培养基平板上设有一至三条V型槽，所述V型槽宽0.5-1mm，槽深0.5-1mm；
（4）注射后饲养：将注射后的虫体放入叶片饲养培养皿中饲养培养基的上面，用封口膜封口，放在光照培养箱内饲养10-14小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：栾军波，闫金阳，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21