一种通过杂交和胚挽救相结合创造水稻三倍体的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过杂交和胚挽救相结合创造水稻三倍体的方法，其步骤包括：a.二倍体水稻的染色体加倍；b.二倍体水稻与四倍体水稻杂交；c.胚挽救；d.愈伤组织分化出苗；e.芽苗生根培养；f.试管苗移栽；g.三倍体植株的鉴定。本发明专利技术通过二倍体水稻与四倍体水稻杂交，采用胚挽救技术培养出水稻三倍体。该技术体系的建立解决了以往水稻三倍体获得效率低的难题，高效创造水稻三倍体，为水稻遗传研究及育种提供材料基础。

A method to create triploid rice by combining hybridization and embryo rescue

【技术实现步骤摘要】
一种通过杂交和胚挽救相结合创造水稻三倍体的方法
本专利技术涉及一种选育植物多倍体的方法，尤其涉及一种通过以二倍体水稻为母本、四倍体水稻父本进行杂交，结合对幼胚进行胚挽救创造水稻三倍体的方法，属于现代农业的作物遗传育种

技术介绍
三倍体(Triploid)是指体细胞内含有三个染色体组的生物体。三倍体植物在遗传学研究及遗传育种中具有重要作用。在育种实践中，可利用三倍体高度不育的特点选育无籽果实，如三倍体无籽西瓜等的选育；或利用某些三倍体植物的生长优势，选育速生优质高抗植物新品种，如三倍体漆树、三倍体杨树等(张英涛和尤瑞麟，1999；康向阳，2003)。水稻三倍体则主要用于基础研究或作为育种中间材料。(一)利用水稻三倍体与二倍体杂交，可以得到三体、双三体和四体等非整倍体材料(徐培洲，2006)。而非整倍体是进行基因的染色体定位、染色体的重复效应、基因剂量效应等研究的重要材料(李树贤，2008)。(二)水稻三倍体是发掘无融合生殖基因的好材料。在被子植物中表现无融合生殖特性的植物大部分具有多倍性，加之三倍体的高度不育性，为潜在无融合生殖基因的表达创造了有利的内部环境，比二倍体条件下更有助于筛选出无融合生殖种质(黄群策，1995；刘永胜和孙敬三，1996)。而无融合生殖是实现水稻“一系法”育种、固定杂种优势的关键(袁隆平，1987)。(三)水稻三倍体是获得水稻六倍体的桥梁。通过三倍体植株的染色体加倍，可以获得更高倍性的六倍体植株，因此三倍体是六倍体育种的关键中间材料。目前获得水稻三倍体的方法，主要是利用四倍体水稻做母本、二倍体水稻为父本进行杂交，获得杂交种子进行种植，再筛选获得三倍体植株。但这种方法获得三倍体植株的效率极低，首先很难获得杂交种子，即使偶尔获得杂交种子，往往也并非三倍体。传统观点一般认为，在四倍体植株与二倍体植株杂交时，以四倍体做母本、二倍体做父本更容易成功，因为二倍体植株能够提供大量正常花粉，从而有较高的结实率。但专利技术人通过近几年在水稻中的杂交实验，发现以四倍体做母本、二倍体做父本进行杂交，几乎不能获得杂交种子。而以二倍体做母本、四倍体做父本却能得到杂交种子，这可能涉及到胚和胚乳染色体数目的平衡性问题。因正、反交胚乳的染色体数目是不同的，具体表现为：四倍体做母本、二倍体做父本时，胚乳为5x，染色体数目60条；而二倍体做母本、四倍体做父本时，胚乳为4x，染色体数目48条；两种情况下胚的倍性均为3x，染色体数目36条。可见二倍体做母本、四倍体做父本时，胚乳与胚的倍性和染色体数目更接近，平衡性更好，可能更有利于胚的发育。但即使采用二倍体做母本、四倍体做父本进行杂交，最后得到的杂交种子仍较少，后发现授粉后最初几天膨大的子房数明显多于最后的结实数，说明有很多幼胚在发育过程中可能由于缺乏营养而停止发育，因此可采用幼胚培养对胚加以挽救，从而获得更多三倍体植株。综合以上研究结果，本专利技术提出了一种通过杂交和胚挽救相结合创造水稻三倍体的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种通过杂交和胚挽救相结合创造水稻三倍体的方法，解决了以往水稻三倍体获得效率低的难题，高效创造水稻三倍体，为水稻遗传研究及育种提供材料基础。本专利技术的技术方案为：a.二倍体水稻的染色体加倍；b.二倍体水稻与四倍体水稻杂交；c.胚挽救；d.愈伤组织分化出苗；e.芽苗生根培养；f.试管苗移栽；g.三倍体植株的鉴定。本专利技术的具体过程为：a.二倍体水稻的染色体加倍选择需要获得三倍体的二倍体水稻品种作为基础材料。以秋水仙素作为诱导剂，将二倍体水稻通过活体或离体诱导染色体加倍，获得四倍体水稻。b.二倍体水稻与四倍体水稻杂交同期种植二倍体和四倍体水稻，在二者开花期间，授粉前一天下午将二倍体水稻剪颖去雄后套杂交袋，作为母本；次日取父本四倍体水稻的花粉授至母本柱头。c.胚挽救授粉后10～12天，剪取杂交稻穗，剥出膨大子房，经消毒处理后，接种到胚挽救培养基中，置于25℃条件下暗培养。胚挽救培养基配方为：N6+6-BA0.5mg/L～1.0mg/L+NAA0.5mg/L～1.0mg/L+CH100mg/L+Sucrose5％+Agar0.75％，pH6.0。d.愈伤组织分化出苗胚挽救培养过程中，幼胚被诱导形成愈伤组织或萌发出苗。将生长旺盛的愈伤组织转移至分化培养基，置于25℃、光照10～12h/d条件下培养，至分化出苗；或将萌发的幼苗转移至分化培养基，置于25℃、光照10～12h/d条件下培养，继续生长。分化培养基配方：MS+6-BA1.0mg/L～1.5mg/L+KT1.0mg/L～2.0mg/L+NAA0.2mg/L～0.3mg/L+Sucrose3％+Agar0.75％，pH6.0。e.芽苗生根培养待芽苗长至3～5cm时，将其转入生根培养基中，25℃光照条件下培养，芽苗生根形成完整的小植株。生根培养基配方：1/2MS+6-BA0.1mg/L～0.3mg/L+NAA0.3mg/L～0.5mg/L+ActivatedCarbon0.02％+Sucrose2％+Agar0.75％，pH6.0。f.试管苗移栽待试管苗根数3～5条，根长2～3cm时，揭开培养瓶的封口膜，加入0.5～1cm深的无菌水，25℃炼苗2～3天；用清水洗净试管苗根部琼脂后，移栽于水田或稻缽中，移栽后最初几天注意遮阳及防淹水过深。g.三倍体植株的鉴定通过形态学、细胞学、流式细胞分析三个方面对三倍体植株进行综合鉴定。形态学鉴定主要从株高、穗长、粒长、粒宽、穗粒数、芒长、结实率等方面对植株进行测量统计，最明显的特征为三倍体表现高度不育，基本不结实。细胞学鉴定通过根尖染色体计数观察染色体数目，从而确定三倍体植株，是倍性鉴定最确凿的证据；三倍体水稻染色体数为2n＝3x＝36，而二倍体水稻和四倍体水稻的染色体数目分别为2n＝2x＝24和2n＝4x＝48。流式细胞分析通过检测细胞核DNA含量从而快速确定植株倍性，三倍体植株的DNA含量峰值处于二倍体和四倍体之间，且符合相应倍数关系。本专利技术通过以二倍体水稻为母本、四倍体水稻父本进行杂交，结合对幼胚进行胚挽救，建立了高效创造水稻三倍体的方法，为水稻基础遗传研究及育种提供材料基础。附图说明图1水稻二倍体、三倍体、四倍体流式细胞分析左：A3-2x；中：A3-3x；右：A3-4x图2水稻三倍体(A3-3x)根尖染色体图3水稻二倍体、三倍体、四倍体植株左：A3-2x；中：A3-3x；右：A3-4x图4水稻二倍体、三倍体、四倍体稻穗左：A3-2x；中：A3-3x；右：A3-4x图5水稻二倍体、三倍体、四倍体籽粒左：A3-2x；中：A3-3x；右：A3-4x具体实施方式下面以实施例三倍体水稻A3-3x的创造对本专利技术进一步说明。a.二倍体水稻的染色体加倍以二倍体水稻品种A3-2x作为基础材料，通过组织培养和秋水仙素处理相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过杂交和胚挽救相结合创造水稻三倍体的方法，其特征在于过程为：a.二倍体水稻的染色体加倍；b.二倍体水稻与四倍体水稻杂交；c.胚挽救；d.愈伤组织分化出苗；e.芽苗生根培养；f.试管苗移栽；g.三倍体植株的鉴定。/n

【技术特征摘要】
1.一种通过杂交和胚挽救相结合创造水稻三倍体的方法，其特征在于过程为：a.二倍体水稻的染色体加倍；b.二倍体水稻与四倍体水稻杂交；c.胚挽救；d.愈伤组织分化出苗；e.芽苗生根培养；f.试管苗移栽；g.三倍体植株的鉴定。


2.根据权利要求1所述的一种通过杂交和胚挽救相结合创造三倍体水稻的方法，其特征在于具体过程为：
a.二倍体水稻的染色体加倍
选择需要获得三倍体的二倍体水稻品种作为基础材料，以秋水仙素作为诱导剂，将二倍体水稻通过活体或离体诱导染色体加倍，获得四倍体水稻；
b.二倍体水稻与四倍体水稻杂交
同期种植二倍体和四倍体水稻，在二者开花期间，授粉前一天下午将二倍体水稻剪颖去雄后套杂交袋，作为母本；次日取父本四倍体水稻的花粉授至母本柱头；
c.胚挽救
授粉后10～12天，剪取杂交稻穗，剥出膨大子房，经消毒处理后，接种到胚挽救培养基中，置于25℃条件下暗培养；胚挽救培养基配方为：N6+6-BA0.5mg/L～1.0mg/L+NAA0.5mg/L～1.0mg/L+CH100mg/L+Sucrose5％+Agar0.75％，pH6.0；
d.愈伤组织分化出苗
胚挽救培养过程中，幼胚被诱导形成愈...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋兆建，屈天歌，贺文婷，王维，张献华，蔡得田，何玉池，刘育华，
申请(专利权)人：湖北大学，武汉多倍体生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42