一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法，属于分析检测技术领域。所述方法包括以下步骤：样品预处理；样品提取；用双柱串联‑液相色谱‑质谱法对样品进行分离检测；采用样品的峰面积和标准曲线进行定量分析。本发明专利技术能同时分析烟叶中13种物质含量，对新烟叶品种的培育有着重要的科研意义，同时对各类烟叶的品质鉴定有着广泛的应用前景。同时检出限低，灵敏度高，对于痕量烟碱成分能有效进行检测鉴定；准确定量范围较大，适合同一种提取方法下，不同种类和不同生长阶段的烟叶中烟碱的分析鉴定。

A method for simultaneous determination of 13 substances in tobacco leaves

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法
本专利技术实施例涉及分析检测
，具体涉及一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法。
技术介绍
在烟叶/烟草成分的检测中，尼古丁(NT)、尼古丁代谢产物(HC、CT、NNT、AT、AB)以及烟草特有的亚硝胺类致癌物质(NNN、NNK、NAT、NAB)为常见的检测目标物。为了降低与吸烟相关的疾病风险，当今许多科研者利用生物转化的方法，开发研究低NT含量的烟叶。最新研究表明，6-HN、2-HN、AK为三种重要的NT代谢物，是研究低NT的关键生物标记物，对新烟叶品种的培育有着重要的科研意义。因此，建立NT、CT、HC、NNT、AT、AB、AK、2-HN、6-HN、NNN、NNK、NAT、NAB的同时快速检测方法对烟叶新品种培育和各类烟叶的品质鉴定有着广泛的应用前景。传统的滴定法、紫外-可见分光光度法、水蒸气测定法可检测烟碱的含量。然而这些方法只能检测出烟碱的总量，且要求的化学反应试剂繁多，测定也易受很多环境因素影响。GC-MS(气相色谱法-质谱联用)的方法被用于检测烟叶中烟碱及一些代谢物，然而其操作方法复杂，稳定性较差。近几年，对NT及其代谢物的检测集中于LC-MS/MS(液相色谱-质谱/质谱联用)。然而，大多数方法只检测NT及其手性化合物；或同时检测NT、CT、HC、NNT、AT、AB、NNN、NNK、NAT、NAB。如下列举两种常见的烟叶检测方法：方法一：使用反相LC和WatersBEHC18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)。在35℃柱温条件下进行分离，流动相组成为：A(0.2mmol/L乙酸铵水溶液)B(0.2mmol/L乙酸铵的甲醇溶液)，流速为0.6mL/min。梯度洗脱程序如下：第0-1min，0％流动相B，第1.0-2.1min，流动相B从0％线性增加到60％，然后在接下来的0.9min中，流动相B增加到100％。总运行时间为4min，包括1min的平衡时间(McGuffey,J.E.,Wei,B.,Bernert,J.T.,Morrow,J.C.,Xia,B.,Wang,L.,&Blount,B.C.(2014).ValidationofaLC-MS/MSmethodforquantifyingurinarynicotine,sixnicotinemetabolitesandtheminortobaccoalkaloids--anatabineandanabasine--insmokers'urine.PLoSONE,9(7),e101816.)。该方法可同时检测NT、CT、NNT、AT、AB、二烯烟碱、米喔斯明烟碱，而AK、2-HN、6-HN并未包括在其中。方法二：使用HPLC色谱柱PhenomenexGemini-NX，C18，110A，(4.6×150mm，5μm)。流动相A为6.5mM乙酸铵(pH＝10.5)，流动相B为乙腈。色谱洗脱程序为：第0-0.02min，流动相B从0％升至3％，并保持到1min；第1-9min，流动相B从3％升至30％，并保持到10.05min；第10.05-10.51min，流动相B从30％升至100％，并保持到11.2min；在11.21min，流动相B从100％降回3％，并保持到13.5min(Li,Y.,Pang,T.,Shi,J.,Lu,X.,Deng,J.,&Lin,Q.(2015).SimultaneousDeterminationofAlkaloidsandTheirRelatedTobacco-SpecificNitrosaminesinTobaccoLeavesUsingLC–MS-MS.JChromatogrSci,53(10),1730-1736.)。该方法可同时检测NT、CT、HC、NNT、AT、AB和降烟碱，而AK、2-HN、6-HN并未包括在其中。现有检测方法只能同时分析NT、CT、HC、NNT、AT、AB、NNN、NNK、NAT、NAB，然而对于尼古丁微生物转化产物AK、2-HN和6-HN与烟碱化合物和N-亚硝胺化合物的同时检测分离未见报道。因此，开发一种灵敏度高，准确可靠的同时快速检测NT、CT、HC、NNT、AT、AB、AK、2-HN、6-HN、NNN、NNK、NAT、NAB的方法对鉴定烟叶品质，开发研究低尼古丁的烟叶作物；以及分离有益烟碱成分，开发药用成分，辅助神经类疾病治疗有着重要的意义。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法，以解决现有技术存在的问题。烟叶中烟碱的常规检测多集中于几种常见的成分，如烟碱类化合物NT、CT、HC、NNT、AT、AB、和亚硝胺类化合物(NNN、NNK、NAT、NAB)，然而对于尼古丁微生物转化产物AK、2-HN和6-HN的分离尚未见报道。尤其是2-HN和6-HN为同分异构体，因其分子量相同，结构相似，在质谱检测中具有相同的前体离子和产物离子碎片。仅通过质谱的多反应监测(MRM)模式，无法达到鉴定两种化合物的目的。因此，分离AK、2-HN和6-HN，并同时检测NT、CT、HC、NNT、AT、AB、AK、2-HN、6-HN、NNN、NNK、NAT、NAB共13种化合物是本专利技术要解决的问题之一。现有检测烟碱及其代谢物的方法灵敏度较低。在烟叶新品种培育过程中，一些通过生物转化的尼古丁相关代谢产物浓度较低，因此要求有较低的检出限即高灵敏度。同时，由于烟叶的品种繁多，其烟碱的含量有几倍甚至几百倍的差别。现有的检测方法准确定量范围小，对于烟碱含量较高的品种需要多次稀释，对于烟碱含量低的品种需要浓缩步骤，无法达到同时提取同时检测的目的。因此，降低检出限，提高灵敏度，是痕量烟碱的检测的技术难点；提高准确定量范围，是降低提取检测成本的技术难点。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：本专利技术提供了一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)样品预处理：将烟叶冷冻干燥磨粉，得到预处理的烟叶；(2)样品提取：取预处理的烟叶置于收集容器中，加入萃取剂，经过离心，收集上清液，二次提取，经滤膜过滤后的滤液作为样品溶液；(3)用双柱串联-液相色谱-质谱法对样品进行分离检测；(4)采用样品的峰面积和标准曲线进行定量分析，计算得到烟叶中13种物质含量；其中，所述13种物质为：尼古丁(NT)、3-羟基可替宁(HC)、可替宁(CT)、降烟碱(NNT)、安那他品(AT)、假木贼碱(AB)、氨基酮[4-(甲基氨基)-1-(3-吡啶基)1-丁酮](AK)、6-羟基烟碱(6-HN)、2-羟基烟碱(2-HN)、N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)。进一步地，步骤1中，在-50～-80℃冷冻干燥1～3h，磨粉后过40目筛。冷冻干燥方法进行前处理，既可以最大程度上保证烟叶中烟碱和各类代谢物的稳定性，另本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n(1)样品预处理：将烟叶冷冻干燥磨粉，得到预处理的烟叶；/n(2)样品提取：取预处理的烟叶置于收集容器中，加入萃取剂，经过离心，收集上清液，二次提取，经滤膜过滤后的滤液作为样品溶液；/n(3)用双柱串联-液相色谱-质谱法对样品进行分离检测；/n(4)采用样品的峰面积和标准曲线进行定量分析，计算得到烟叶中13种物质含量；/n其中，所述13种物质为：尼古丁(NT)、3-羟基可替宁(HC)、可替宁(CT)、降烟碱(NNT)、安那他品(AT)、假木贼碱(AB)、氨基酮[4-(甲基氨基)-1-(3-吡啶基)1-丁酮](AK)、6-羟基烟碱(6-HN)、2-羟基烟碱(2-HN)、N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)样品预处理：将烟叶冷冻干燥磨粉，得到预处理的烟叶；
(2)样品提取：取预处理的烟叶置于收集容器中，加入萃取剂，经过离心，收集上清液，二次提取，经滤膜过滤后的滤液作为样品溶液；
(3)用双柱串联-液相色谱-质谱法对样品进行分离检测；
(4)采用样品的峰面积和标准曲线进行定量分析，计算得到烟叶中13种物质含量；
其中，所述13种物质为：尼古丁(NT)、3-羟基可替宁(HC)、可替宁(CT)、降烟碱(NNT)、安那他品(AT)、假木贼碱(AB)、氨基酮[4-(甲基氨基)-1-(3-吡啶基)1-丁酮](AK)、6-羟基烟碱(6-HN)、2-羟基烟碱(2-HN)、N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)。


2.根据权利要求1所述的同时检测烟叶中13种物质含量的方法，其特征在于，步骤1中，在-50～-80℃真空冷冻干燥1～3h，磨粉后过40目筛。


3.根据权利要求1所述的同时检测烟叶中13种物质含量的方法，其特征在于，所述萃取剂包括甲酸铵、乙腈和水，重量体积比例为1.0-1.3g：1.0-...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈昳潇，张宁，陶冬冰，赵瑛博，沈向群，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21