本发明专利技术属于T细胞免疫治疗领域，具体涉及CAR‑T技术在预防和治疗冠状病毒感染性疾病中的应用。冠状病毒感染性疾病为SARS‑CoV或nCoV‑19或MERS‑CoV或HCoV‑229E或HCoV‑OC43或HCoV‑NL63或HCoV‑HKU1感染引起的疾病。该疗法效果好，尤其适用于重症感染的应急治疗，受病毒变异影响小，可应用于大范围预防免疫。
Application of car-t technology in the prevention and treatment of coronavirus infectious diseases
【技术实现步骤摘要】
CAR-T技术在预防和治疗冠状病毒感染性疾病中的应用
本专利技术属于T细胞免疫治疗领域，具体涉及CAR-T技术在预防和治疗冠状病毒感染中的应用。专利技术背景迄今为止，目前共发现7种可感染人类的冠状病毒，其中，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和2019新型冠状病毒(nCoV-19)所致疾病的严重程度以及社会影响更大。其余是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1。感染nCoV-19、SARS和MERS病毒，会导致严重的肺炎，以发热为首发症状，偶有畏寒，同时伴有头痛、关节酸痛和全身酸痛、乏力。另外有明显的呼吸道症状：干咳、少痰，个别病人偶有血丝痰，部分病人出现呼吸加速、气促等上呼吸道病毒感染症状，严重引起呼吸衰竭死亡。冠状病毒多在上皮组织中生长，主要通过鼻、眼、呼吸道粘膜感染，可以通过皮下注射感染。冠状病毒的抗原变异性高，存在有多种血清型并有抗原的变异，导致疫苗和特异性抗体研究困难重重，已经接种疫苗的人群可以发生重复感染。针对不断变异的野生病毒，目前尚无特效预防和治疗手段。冠状病毒基因组序列具有同源性，可分为4个属，α，β，γ和δ。γ和δ冠状病毒属只感染动物，α冠状病毒属包括人冠状病毒29E和NL63，β冠状病毒属包括4个家系，HKU1和OC43属于A家系；B家系包括SARS，与重症肺炎有关；MERS则属于β冠状病毒C家系。冠状病毒属的病毒是具外套膜的正链单股RNA病毒。病毒包膜上存在棘突，不同的冠状病毒的棘突差异明显，看似冠状，所以命名为“冠状病毒”。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(S，SpikeProtein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)；小包膜糖蛋白(E，EnvelopeProtein，较小，与包膜结合的蛋白)；膜糖蛋白(M，MembraneProtein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。少数种类还有血凝素糖蛋白(HE蛋白，Haemaglutinin-esterase)。冠状病毒的核酸为非节段单链(+)RNA，长27-31kd，是RNA病毒中最长的RNA核酸链，具有正链RNA特有的重要结构特征：即RNA链5’端有甲基化“帽子”，3’端有PolyA“尾巴”结构。这一结构与真核mRNA非常相似，也是其基因组RNA自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础，而省去了RNA-DNA-RNA的转录过程。冠状病毒的RNA和RNA之间重组率非常高，病毒极易出现变异。抗原性发生变化的结果是导致原有疫苗失效。冠状病毒致病机制复杂，难以预防和治疗的主要机制有：主动改变宿主细胞状态以便于逃逸免疫清除、进而利于病毒本身复制和存活；2、病毒可以产生micrRNA诱导T抗原表达的减低使得感染细胞躲避T细胞。3、S蛋白是病毒和人体细胞受体结合的桥梁，冠状病毒S蛋白的多样性导致研制疫苗异常困难。4、易出现耐药株。CAR-T(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)被认为是最有前景的免疫治疗方式之一。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。通过注射疫苗引发的抗体保护反应有效期都很有限。而针对保守的内源蛋白引发的T细胞免疫反应保护期则很长。T细胞包含多种亚型，其中细胞毒性T细胞(Tc)对病毒具有直接杀伤作用，辅助性T细胞(Th)协助B细胞产生病毒特异性抗体，调节性T细胞(Treg)调节病毒引起的异常免疫性损伤。记忆T细胞根据功能分为中心记忆T细胞(TCM)和效应记忆T细胞(TEM)。当CAR-T注入机体后，TEM数量显著增加。E/P-选择素+的TEM细胞具有迁移能力，能够进入周围组织。组织常驻T细胞(TRM)是一群特殊的TEM，感染结束后能长期存活于周围组织中。当同类病毒入侵时，TRM不依赖外周血记忆T细胞迅速清除病毒，对多种同类病毒感染都具有长期的保护作用。但目前TRM细胞还无法进行分离和培养，如何安全诱导机体大量产生TRM细胞预防病毒感染仍然是个难题。病毒特异性CAR-T技术与病毒疫苗相比的优势：1、疫苗注射后逐渐产生抗体，CAR-T技术抗病毒作用快，可以根据不同人群需求调整剂量和给药途径，适用于重症患者的个体化应急治疗；2、针对冠状病毒保守膜抗原的CAR-TRM可以长期存在于鼻粘膜、眼结膜、呼吸道和皮肤中，能有效抵御多种同类病毒入侵，抗病毒作用更为广泛持久，适合于大规模人群预防免疫。病毒进入组织细胞后，血液中的抗体便不能发挥作用，此时需要通过效应T细胞来杀伤细胞中的病毒。嵌合抗原抗体(CAR)可以通过基因和细胞工程技术制备，随着自动化的CAR-T细胞制备工艺涌入市场，治疗成本大幅下降。CAR-T细胞可以诱导组织TRM细胞增多，TRM细胞能够长期存在于组织中，阻止多种同类病毒再次入侵感染。疫苗虽然也可以诱导机体产生TRM细胞，但细胞数量有限。针对冠状病毒极易变异的特点，皮下注射CAR-T适用于普通人群的基础免疫，弥补疫苗的不足。CAR-T在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的免疫治疗方式之一，多次创造癌症治疗的奇迹。在非肿瘤性疾病中，CAR-T技术治疗研究最多的感染性疾病是艾滋病。迄今为止，还没有CAR-T技术用于治疗和预防冠状病毒感染的研究报道。
技术实现思路
本项目通过基因工程技术合成嵌合抗原受体，制备质粒电转T细胞分别获得特异性和保守性SARS-CoV膜蛋白CAR-T细胞；通过体外细胞培养显示CAR-T组分泌对病毒有杀伤作用的细胞因子IL-2和IFN-r，明显高于对照T细胞组。分别通过小鼠尾静脉和皮下注射输入SARS-CoV特异性S膜蛋白CAR-T细胞，显示小鼠外周血中效应T细胞较对照组增多，具有抗病毒作用；同时显示SARS-CoV膜蛋白CAR-T能通过增加鼻上皮组织中TRM细胞，使机体获得对同类冠状病毒的长期免疫力，抵御病毒再次感染。冠状病毒基因组序列具有同源性，冠状病毒属的病毒都是具外套膜的正链单股RNA病毒。病毒膜表面的一些膜糖蛋白在各种冠状病毒中具有高度的保守性。因此CAR-T对SARS-CoV的治疗和预防作用可以推广应用到其他冠状病毒感染的防治。基于上述研究，本专利技术涉及了CAR-T疗法在治疗和预防冠状病毒感染性疾病中的应用，其特征在于所述冠状病毒感染性疾病为SARS-CoV或nCoV-19或MERS-CoV或HCoV-229E或HCoV-OC43或HCoV-NL63或HCoV-HKU1感染引起的疾病。优选地，所述CAR-T疗法在通过静脉滴注或者皮下注射治疗和预防冠状病毒感染性疾病中的应用；进一步优选地，CAR-T疗法在静脉滴注或者皮下注射治疗和预防SARS-CoV冠状病毒感染性疾病中的应用，所述CAR-T疗法在静脉滴注或者皮下注射治疗和预防nCoV-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.CAR-T疗法在治疗和预防冠状病毒感染性疾病中的应用，其特征在于所述CAR-T疗法属于T细胞免疫治疗领域，其特征在于所述冠状病毒为SARS-CoV或nCoV-19或MERS-CoV或HCoV-229E或HCoV-OC43或HCoV-NL63或HCoV-HKU1；其特征在于所述冠状病毒感染性疾病为SARS-CoV或nCoV-19或MERS-CoV或HCoV-229E或HCoV-OC43或HCoV-NL63或HCoV-HKU1感染引起的疾病。/n
【技术特征摘要】
1.CAR-T疗法在治疗和预防冠状病毒感染性疾病中的应用，其特征在于所述CAR-T疗法属于T细胞免疫治疗领域，其特征在于所述冠状病毒为SARS-CoV或nCoV-19或MERS-CoV或HCoV-229E或HCoV-OC43或HCoV-NL63或HCoV-HKU1；其特征在于所述冠状病毒感染性疾病为SARS-CoV或nCoV-19或MERS-CoV或HCoV-229E或HCoV-OC43或HCoV-NL63或HCoV-HKU1感染引起的疾病。
2.根据权利要求1所述CAR-T疗法在治疗和预防冠状病毒感染性疾病中的应用，其特征在于所述CAR-T的抗原是冠状病毒膜蛋白。
3.根据权利要求1所述CAR-T疗法在治疗和预防冠状病毒感染性疾病中的应用，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏，奚肇庆，崔盘根，
申请(专利权)人：中国医学科学院皮肤病医院中国医学科学院皮肤病研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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