一种基于功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法，属于生物医学领域中核酸检测方法。本发明专利技术的技术方案主要包括：制备出对硝基苯功能化黑磷；然后将对硝基苯功能化黑磷用于单链核苷酸序列的检测。本发明专利技术对硝基苯功能化黑磷可以提高黑磷区分单链DNA和双链DNA的能力，在人血清中可以实现ctDNA的快速灵敏检测，检测限可达0.5nM及以下。与此同时，在人血清中，本发明专利技术对硝基苯功能化黑磷对ctDNA具有很强的专一性，即使是单碱基的突变或缺失，也能被识别。

Detection of circulating tumor nucleic acids based on functional black phosphorus biosensor

【技术实现步骤摘要】
一种基于功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法
本专利技术是一种功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法，具体涉及对硝基苯功能化黑磷生物传感器的构建，属于生物医学领域中的循环肿瘤核酸检测方法。
技术介绍
癌症是一种基因突变引起的疾病。肿瘤专家认为，对癌症的早期发现、早期诊断和早期治疗，可以有效的提高患者生存期和生活质量。循环肿瘤核酸(ctDNA)是当肿瘤细胞死亡时，DNA分子从其支离破碎的基因组中释放到体液中，是一种重要的肿瘤生物标志物。目前，ctDNA检测方法主要采用二代测序，聚合酶链式反应和数字聚合酶链式反应等方法进行检测，但这些检测方法存在着一定的局限性，如操作复杂，检测时间长，成本高且对实验操作人员实验技能有要求。申请号CN106918583A，披露了一种利用黑磷纳米薄片构建核酸适体生物传感器制备方法和应用，其构建二维黑磷核酸适体探针，实现对肿瘤细胞的检测。该方法中二维黑磷纳米片作为荧光探针淬灭剂，并不能高特异、高灵敏地检测核酸分子。申请号CN105300950A，披露了一种部分还原氧化石墨烯的DNA荧光传感器制备方法和应用，其构建部分还原石墨烯DNA荧光传感器，可以高灵敏检测DNA。同样，该石墨烯对单链DNA探针起到淬灭作用，但是石墨烯DNA荧光传感器并不能高特异高灵敏地检测血清中的DNA。目前，ctDNA检测方法主要采用二代测序，聚合酶链式反应和数字聚合酶链式反应的方法进行检测，但这些检测方法存在着一定的局限性，如操作复杂，检测时间长，成本高且对实验操作人员有较高的实验技能要求。黑磷具有褶皱型结构，比表面积大，吸附能比较大，可以吸附更多的物质。但仍然存在一定的灵敏度不高和专一性差等问题。鉴于现有的单链DNA检测方法的缺陷，开发出灵敏度高，专一性强，快速检测ctDNA的功能化黑磷生物传感器具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供了一种对硝基苯功能化黑磷生物传感器。本专利技术另一目的在于提供了对硝基苯功能化黑磷生物传感器在检测单链核苷酸序列中的应用。本专利技术再一目的在于提供了一种基于对硝基苯功能化黑磷生物传感器检测单链核苷酸序列的方法。本专利技术所采取的技术方案是：一方面，本专利技术提供一种对硝基苯功能化黑磷生物传感器，其制备方法为：黑磷分散于乙腈溶液中，然后加入对硝基苯四氟硼酸重氮盐，混匀后在黑暗条件下搅拌，离心，所得沉淀清洗干净得对硝基苯功能化黑磷生物传感器。优选的，所述黑磷与对硝基苯四氟硼酸重氮盐的质量比为1：4～6。优选的，所述黑磷选自黑磷纳米片、黑磷量子点、黑磷微纳米颗粒中的至少一种。优选的，所述搅拌时间为18～22小时，所述离心转速为11000～13000转/分，离心时间为8～12分钟。优选的，所述清洗为先用乙醇洗，再用水洗。一方面，本专利技术提供上述任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器在检测单链核苷酸序列中的应用，所述应用不包括疾病的诊断或治疗。一方面，本专利技术提供上述任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器在制备检测单链核苷酸序列产品中的应用。优选的，所述单链核苷酸序列包括单链DNA、单链RNA。优选的，所述单链DNA包括ctDNA。一方面，本专利技术提供一种基于对硝基苯功能化黑磷生物传感器检测单链核苷酸序列的方法，包括以下步骤：1)将能够检测目标单链核苷酸序列的荧光标记的单链DNA探针和待测样品溶液混合，杂交反应后再加入上述任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器，孵育反应，检测荧光强度；2)若加入对硝基苯功能化黑磷前后荧光强度没有发生显著变化，则待测样品中不存在与探针相结合的目标单链核苷酸序列；若加入对硝基苯功能化黑磷后，荧光强度显著变弱，则待测样品溶液中存在与该探针相结合的目标单链核苷酸序列，从而实现对样品中目标单链核苷酸序列的定性检测；或者根据标准曲线对待测样品溶液中目标单链核苷酸序列进行定量检测；或者，包括以下步骤：1)将能够检测目标单链核苷酸序列的荧光标记的单链DNA探针和上述任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器孵育反应后，再加入待测样品溶液混合，杂交反应后，检测荧光强度；2)若加入待测样品溶液前后荧光强度没有发生显著变化，则待测样品中不存在与探针相结合的目标单链核苷酸序列；若加入待测样品溶液后，荧光强度显著变强，则待测样品溶液中存在与该探针相结合的目标单链核苷酸序列，从而实现对样品中目标单链核苷酸序列的定性检测；或者根据标准曲线对待测样品溶液中目标单链核苷酸序列进行定量检测；或者，包括以下步骤：将能够检测目标单链核苷酸序列的荧光标记的单链DNA探针、上述任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器和待测样品混合反应12～30min，检测荧光强度；根据标准曲线对待测样品溶液中目标单链核苷酸序列进行定量检测。优选的，所述杂交反应的时间为12～20min；所述孵育反应的时间为12～20min。优选的，荧光标记的单链DNA探针与对硝基苯功能化黑磷的用量比为1～10nmol：0.8～5mg。优选的，所述单链核苷酸序列包括单链DNA、单链RNA。优选的，所述单链DNA包括ctDNA。优选的，所述ctDNA包括PIK3CAE542K1624G>A，所述荧光标记的单链DNA探针的序列包括5’-TCAGTGATTTTAGAGAGAGGA-3’(SEQIDNO:1)。优选的，所述待测样品溶液包括血清。本专利技术的有益效果是：本专利技术能够快速灵敏的检测单链核苷酸序列，本专利技术对硝基苯功能化黑磷可以提高黑磷区分单链DNA和双链DNA的能力，在人血清中可以实现ctDNA的快速灵敏检测，检测限可达0.5nM及以下。与此同时，在人血清中，本专利技术对硝基苯功能化黑磷对ctDNA具有很强的专一性，即使是单碱基的突变或缺失，也能被识别。本专利技术针对现有的循环肿瘤核酸检测方法操作复杂，检测时间长，成本高等问题，提出一种功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法。本专利技术对黑磷进行对硝基苯功能化后，展现出更高的灵敏度和专一性。提供了一种快速、简便、灵敏的检测单链核苷酸序列的新方法。该检测新方法所用的对硝基苯功能化黑磷生物传感器制备方法简便，具有更强的吸附单链DNA能力，及检测快速等特点。附图说明图1为黑磷、功能化黑磷与荧光标记单链DNA探针作用的荧光光谱图。图中，横坐标为荧光波长，纵坐标为荧光强度。图2为对硝基苯功能化黑磷(NP-BPs)检测不同浓度血清ctDNA(分别为0、0.5、0.7、1、2.5、5nM)的荧光曲线图。图中，横坐标为荧光波长，纵坐标为荧光强度。图3为对硝基苯功能化黑磷(NP-BPs)检测血清ctDNA的标准曲线。图中，横坐标为ctDNA浓度，纵坐标为荧光强度。图4为黑磷(BPs)检测不同浓度血清ctDNA的荧光曲线图。图中，横坐标为荧光波长，纵坐标为荧光强度。图5为黑磷(BPs)检测血清ctDNA的标准曲线本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对硝基苯功能化黑磷生物传感器，其特征在于，其制备方法为：黑磷分散于乙腈溶液中，然后加入对硝基苯四氟硼酸重氮盐，混匀后在黑暗条件下搅拌，离心，所得沉淀清洗干净得对硝基苯功能化黑磷生物传感器。/n

【技术特征摘要】
1.一种对硝基苯功能化黑磷生物传感器，其特征在于，其制备方法为：黑磷分散于乙腈溶液中，然后加入对硝基苯四氟硼酸重氮盐，混匀后在黑暗条件下搅拌，离心，所得沉淀清洗干净得对硝基苯功能化黑磷生物传感器。


2.根据权利要求1所述的一种对硝基苯功能化黑磷生物传感器，其特征在于，所述黑磷选自黑磷纳米片、黑磷量子点、黑磷微纳米颗粒中的至少一种。


3.根据权利要求1所述的一种对硝基苯功能化黑磷生物传感器，其特征在于，所述搅拌时间为18～22小时，所述离心转速为11000～13000转/分，离心时间为8～12分钟。


4.权利要求1～3任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器在检测单链核苷酸序列中的应用，所述应用不包括疾病的诊断或治疗。


5.权利要求1～3任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器在制备检测单链核苷酸序列产品中的应用。


6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述单链核苷酸序列包括单链DNA、单链RNA。


7.一种基于对硝基苯功能化黑磷生物传感器检测单链核苷酸序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将能够检测目标单链核苷酸序列的荧光标记的单链DNA探针和待测样品溶液混合，杂交反应后再加入权利要求1～3任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器，孵育反应，检测荧光强度；
2)若加入对硝基苯功能化黑磷前后荧光强度没有发生显著变化，则待测样品中不存在与探针相结合的目标单链核苷酸序列；若加入对硝基苯功能化黑...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻学锋，周文华，黄赤，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44