一种Tol2转座子介导的转基因鱼纯系建立方法技术

本发明专利技术涉及转基因鱼技术领域，具体涉及一种Tol2转座子介导的转基因鱼纯系建立方法，具体包括如下步骤：转基因载体的构建，Tol2转座酶mRNA的合成，显微注射线性化质粒DNA和转座酶mRNA的混合液，显微注射后的斑马鱼胚胎，记作P0代，待P0代养殖性成熟后，通过与野生斑马雌鱼测交获得F1代；不同来源F1代个体插入拷贝数的鉴定，筛选出单拷贝数F1个体；筛选目的基因表达量最高的F1代个体，F1代个体测交获得F2代杂合体，F2代杂合体自交获得纯合体F3代，通过该方法建立的转基因鱼纯系，可用于培育性状优良，遗传性状稳定的鱼类新品中，加快遗传性状稳定的转基因鱼新品种的培养进程。

A Tol2 transposon mediated method for the establishment of transgenic fish lines

【技术实现步骤摘要】
一种Tol2转座子介导的转基因鱼纯系建立方法
本专利技术涉及转基因鱼
，具体涉及一种Tol2转座子介导的转基因鱼纯系建立方法。
技术介绍
20世纪末，科研人员建立了大量的果蝇转基因家系，这得益于P因子介导的转基因技术在果蝇中的应用。转基因鱼发展相对缓慢，主要原因是缺少有效的转基因方法，很难获得稳定遗传的转基因家系。将基质附着区MAR和I-SceI核酸酶引入斑马鱼的转基因中，在一定程度上提高了转基因的效率，并产生了一系列的转基因的斑马鱼家系，但是使用这些方法仍然很难在短期内产生数以百计转基因家系家系。来自青鳉的Tol2转座子系统的出现很大程度上改善了这一状况。Tol2转座子系统由转座酶基因和转座酶特异识别的两段序列(Tol2-left/Tol2-right)组成，转座酶基因首先克隆到载体中，在体外转录合成转座酶mRNA，在转基因载体两侧接入转座酶识别序列，然后将转座酶mRNA和含有转座酶识别序列的转基因载体共注射一个细胞时期的斑马鱼受精卵，Tol2转座子系统就会将Tol2-left和Tol2-right序列之间的转基因元件高效的插入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Tol2转座子介导的转基因鱼纯系建立方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1，以pSKDTol2载体作为转基因载体，进行线性化处理和去磷酸化处理，得到线性化质粒，所述pSKDTol2载体包括元件Tol2-CMV-GFP-polyA-Tol2；/nS2，将带有Tol2转座酶基因的pCS2-transposase载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后以线性化的pCS2-transposase载体为DNA模板进行转录，转录结束后去除DNA模板，得到Tol2转座酶mRNA；/nS3，对斑马鱼胚胎显微注射线性化质粒DNA和Tol2转座酶mRNA的混合液，每颗胚胎注射上述混合液的量为1-3nl；...

【技术特征摘要】
1.一种Tol2转座子介导的转基因鱼纯系建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，以pSKDTol2载体作为转基因载体，进行线性化处理和去磷酸化处理，得到线性化质粒，所述pSKDTol2载体包括元件Tol2-CMV-GFP-polyA-Tol2；
S2，将带有Tol2转座酶基因的pCS2-transposase载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后以线性化的pCS2-transposase载体为DNA模板进行转录，转录结束后去除DNA模板，得到Tol2转座酶mRNA；
S3，对斑马鱼胚胎显微注射线性化质粒DNA和Tol2转座酶mRNA的混合液，每颗胚胎注射上述混合液的量为1-3nl；显微注射后的斑马鱼胚胎，记作P0代，待P0代养殖性成熟后，通过与野生斑马雌鱼测交获得F1代；
S4，提取F1代基因组DNA，定量PCR，筛选单拷贝数F1个体；
S5，提取筛选的单拷贝数F1代总RNA，反转录后进行定量PCR，筛选目的基因表达量最高的F1代个体；
S6，以筛选得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：张运生，
申请(专利权)人：湖南文理学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43