果香型酵母、筛选方法及在香烟中的应用技术

本发明专利技术公开了一种果香型酵母、筛选方法及在香烟中的应用。本发明专利技术所述的一种果香型酵母的筛选方法，包括以下步骤：(1)在不同海拔烟草种植区的多个地点，分别取样；(2)称取烟草样品，剪碎后分别放于培养基中，振荡培养，将培养液进行梯度稀释，分别涂布于平板，置于培养箱中培养，挑取生长的单菌落接种到平板；(3)将步骤(2)在平板上培养的单菌落接种于液体培养基，振荡培养；(4)采用嗅香的方式进行感官评价，香味品质越好筛选最佳的果香型酵母。R59菌株产香发酵液过滤后均匀喷洒在烟丝表面，制成卷烟后进行感官综合评价，发酵样品的果香气更浓更饱满，香气的协调性也有增加，余味更干净，能够显著提高抽吸品质。

Fruity yeast, screening method and application in cigarette

【技术实现步骤摘要】
果香型酵母、筛选方法及在香烟中的应用
本专利技术属于微生物及发酵领域，特别涉及一种果香型酵母、筛选方法及在香烟中的应用。
技术介绍
烤烟品质对烟草行业的发展有重要影响，烟叶香气不足一直是制约烟叶品质及其工业可用性的主要因素，特别是随着降焦工艺的发展，烟气中香气会进一步降低，致使卷烟品质下降，吸食者的接受度降低，因而对烟叶的香气品质提出了更高的要求。目前改善烟叶香气品质的措施主要集中在品种选育、改善栽培技术和卷烟加工中加香加料等措施。起始阶段，香料来源主要是化学合成。化学法在成本上有优势，但是合成过程中会接触对人体危害较大的物质，并且产生环境污染。因此，开发新的香料来源逐渐成为趋势。多种微生物发酵已被证实能产生香气物质。其中酵母菌对人体的健康无害，利用酵母菌产香已经在酿酒和食品等领域广泛应用。另外，微生物遗传变异度大，产生的香气物质多种多样，给人丰富的嗅香体验。东方伊萨酵母能够合成特殊的酯类物质，产生蟠桃香；毕赤酵母高产乙酸乙酯，也用于增加果香；球拟酵母能产生浓郁的酱香。酿酒酵母和毕赤酵母混合发酵增加花香果香，尤其热带水果香气。马克斯克鲁维酵母能产生高达400mg/L的苯乙醇，苯乙醇具有典型的玫瑰香型香气的重要成分，是构建香烟香型的重要成分，并且具有增强香气的作用。香气种类丰富的酵母发酵为烟草行业提供了切实可行的另一种香料来源。
技术实现思路
专利技术目的：为了解决现有技术的问题，本专利技术提供了一种果香型酵母、筛选方法及在香烟中的应用。本专利技术利用酵母菌筛选并测定关键致香成分，优化发酵产香条件，并评价发酵产物在香烟增香中的应用效果，旨在丰富烟草行业新颖香气物质的来源，开发具有良好风味的新型香烟。技术方案：本专利技术第一方面提供了一种果香型酵母的筛选方法，包括以下步骤：(1)在不同海拔烟草种植区的多个地点，上部叶、中部叶、下部叶分别取样；(2)称取烟草样品，剪碎后分别放于YPD培养基或牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养，将培养液进行梯度稀释，分别涂布于YPD平板和牛肉膏蛋白胨平板，置于培养箱中培养，挑取生长的单菌落接种到平板；(3)将步骤(2)在平板上培养的单菌落接种于液体培养基，振荡培养；(4)采用嗅香的方式进行感官评价，根据香味品质筛选最佳的果香型酵母。步骤(2)中，所述的振荡培养条件为25-28℃下振荡培养2-3d。步骤(3)中，所述的梯度稀释倍数为104-106。本专利技术第二方面提供了上述的果香型酵母的筛选方法得到的果香型酵母。本专利技术第三方面提供了一种果香型酵母的发酵培养基，包括20-30g/L葡萄糖，15-35g/L玉米浆粉，所述培养基的pH为5.0-6.0。本专利技术第四方面提供了一种果香型酵母在香烟中的应用。本专利技术第五方面提供了所述果香型酵母在香烟中的应用方法，包括以下步骤：(a)一级培养：将YPD平板培养的酵母接种于YPD液体培养基中，在25-28℃和160-200rpm下振荡培养24-36h；(b)二级培养：取步骤(a)中得到的菌液接入发酵培养基中，发酵培养基为20-30g/L葡萄糖，15-35g/L玉米浆粉，所述发酵培养基的pH为5.0-6.0；(c)将步骤(b)中得到的过滤液过滤后，均匀喷洒在烟丝表面，制成卷烟。上述的应用方法，步骤(b)中，菌液的接种量为5-10％。上述的应用方法，步骤(c)中，菌液与烟丝的体积质量比为5-20μL/g。有益效果：(1)本专利技术筛选到了R59菌株酵母，具有更有特色的果香型香气；(2)本专利技术通过对果香型酵母发酵条件进行筛选，在最佳的培养条件下，苯乙醛和醋酸异戊酯的浓度分别达到348.6μg/mL和143.7μg/mL，比原始YPD培养基分别提高30％以上和10％以上；(3)本专利技术将R59菌株酵母的发酵液添加至烟丝中，能显著改善香烟的香气特征，R59菌株产香发酵液过滤后均匀喷洒在烟丝表面，制成卷烟后进行感官综合评价，发酵样品的果香气更浓更饱满，香气的协调性也有增加，余味更干净，能够显著提高抽吸品质。附图说明图1为R59菌株的菌落形态，其中，A为R59菌株在平板上的菌落形态，B为R59菌株在显微镜下细胞形态图；图2为基于R59菌株ITSDNA序列的聚类分析结果；图3为不同的发酵条件对香气物质生产的影响，其中，a为不同的葡萄糖浓度对香气成分的影响，b为不同的氮源种类对香气成分的影响，c为不同的玉米浆浓度对香气成分的影响，d为不同的培养基pH，每个数据取三次重复并计算方差。具体实施方式一、材料与方法1.1材料、试剂和仪器2018年7月采自湖北省恩施土家族自治州利川市不同海拔烟草种植区的19个地点，上部叶、中部叶、下部叶分别取样。1.2试剂和培养基试验试剂：Taq酶等PCR试剂、DNA分子量Marker、DNA提取试剂盒和PCR引物均购自青岛擎科生物科技有限公司；蛋白胨(peptone)、酵母粉(Yeastextract)、葡萄糖(Glucoseconcentration)、氯化钠、胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵和琼脂等培养基成分购自国药集团化学试剂有限公司；玉米浆(CSP)、玉米蛋白粉(Cornproteinpowder)和豆饼粉(Soybeancakepowder)购自青岛科瑞培养基公司；苯乙醛、醋酸异戊酯、乙酸苯乙酯、二氯甲烷和甲醇等色谱纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司。培养基：细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，酵母菌和真菌采用YPD固体培养基，酵母菌液体培养采用YPD液体培养基。YPD固体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂25g/L，115℃高压蒸汽灭菌30min。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。1.3烟草微生物的分离称取烟草样品10.0g，剪碎或者后分别放于YPD培养基或牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃下振荡培养2d。将培养液进行梯度稀释，稀释倍数为104到106，分别涂布于YPD平板和牛肉膏蛋白胨平板，每个平板涂布100μl，置于28℃培养箱中培养2d。挑取生长的单菌落接种到平板，于28℃培养箱中培养2d，无菌保种液冲洗菌体，悬液收集于保种管，保藏在本实验室的-80℃超低温冰箱，建立菌株资源库。1.4产果香微生物的筛选从菌株资源库中取单个菌株在平板上活化，接种于液体培养基，在28℃和160rpm下振荡培养36h。采用嗅香的方式进行感官评价并赋分，分数越高，香味品质越好筛选最佳的产果香微生物。差异度由小到大满分10分，香气由弱到强满分20分，留香时间由短暂到持久满分10分，刺激性由大到小满分10分。1.5果香酵母菌的鉴定参照Kurtzman(2000)的方法进行鉴定。将R59菌株在YPD固体斜面上于28℃培养两天，观察菌落特征并利用显微镜观察细胞形态，继续完成生理生化特性分析。PCR扩增提取菌株的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种果香型酵母的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)在不同海拔烟草种植区的多个地点，上部叶、中部叶、下部叶分别取样；/n(2)称取烟草样品，剪碎后分别放于YPD培养基或牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养，将培养液进行梯度稀释，分别涂布于YPD平板和牛肉膏蛋白胨平板，置于培养箱中培养，挑取生长的单菌落接种到平板；/n(3)将步骤(2)在平板上培养的单菌落接种于液体培养基，振荡培养；/n(4)采用嗅香的方式进行感官评价，根据香味品质筛选最佳的果香型酵母。/n

【技术特征摘要】
1.一种果香型酵母的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在不同海拔烟草种植区的多个地点，上部叶、中部叶、下部叶分别取样；
(2)称取烟草样品，剪碎后分别放于YPD培养基或牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养，将培养液进行梯度稀释，分别涂布于YPD平板和牛肉膏蛋白胨平板，置于培养箱中培养，挑取生长的单菌落接种到平板；
(3)将步骤(2)在平板上培养的单菌落接种于液体培养基，振荡培养；
(4)采用嗅香的方式进行感官评价，根据香味品质筛选最佳的果香型酵母。


2.根据权利要求1所述的果香型酵母的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的振荡培养条件为25-28℃下振荡培养2-3d。


3.根据权利要求1所述的果香型酵母的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的梯度稀释倍数为104-106。


4.根据权利要求1所述的果香型酵母的筛选方法得到的果香型酵母。


5.一种如权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，王致鹏，樊俊，师超，申国明，李金海，高加明，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37