一种美洲大蠊肠道菌群代谢产物的检测方法技术

本发明专利技术关于分析检测技术领域，尤其涉及一种美洲大蠊肠道菌群代谢产物的检测方法。该检测方法为超高效液相色谱法，通过对色谱条件进行限定，可同时测定美洲大蠊粪便中6种含氮化合物的含量，高效、灵敏、操作简单，为美洲大蠊肠道菌群代谢产物研究提供了新技术。

A method for the detection of metabolites in intestinal flora of Periplaneta americana

【技术实现步骤摘要】
一种美洲大蠊肠道菌群代谢产物的检测方法
本专利技术关于分析检测
，尤其涉及一种美洲大蠊肠道菌群代谢产物的检测方法。
技术介绍
美洲大蠊(PeriplanetaAmericanaL.)为蜚蠊科大蠊属昆虫，是一种传统中药，中医临床常用于除寒热、破积聚、健脾消疳等。现代研究表明，美洲大蠊具有丰富的活性成分和良好的药理作用。近年来，以美洲大蠊为原料，已成功研发出用于预治胃肠疾病、慢性乙型肝炎或心血管系统疾病等的多种新药，成本低廉、毒副作用小，防治效果较好。肠道菌群是动物肠道内与肠粘膜结合或黏附的微生物，能对宿主摄入的食物进行生物转化，产生的代谢产物可以影响宿主的健康和生命力。现代医学聚焦动物肠道菌群及其代谢产物研究，探索肠道微生物的功能特性，解析肠道菌群与宿主间的代谢调控机制，并尝试利用动物肠道菌群代谢产物治疗疾病。美洲大蠊分布广泛，具有对复杂环境的强大适应能力，推测这与其肠道菌群代谢产物中活性成分有关。因此，有必要对美洲大蠊肠道菌群代谢产物进行检测，但目前尚无关于其肠道菌群含氮代谢产物的检测方法。
技术实现思路
针对目前现有技术中缺乏美洲大蠊肠道菌群代谢产物检测方法的问题，本专利技术提供一种美洲大蠊肠道菌群含氮代谢产物的检测方法。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种美洲大蠊肠道菌群代谢产物的检测方法，所述代谢产物包括5-羟基吲哚啉-2-酮、6-羟基-3,4-二氢-1H-2-喹啉酮、8-羟基-2-喹啉酮、羟吲哚、8-羟基-3,4-二氢-2-喹啉酮、8-羟基-2-喹啉酸；所述检测方法为超高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相A为0.08～0.12％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：0～5min，流动相A98％～93％；5～9min，流动相A93％～90％；9～19min，流动相A90％～78％；19～20min，流动相A78％～98％；流速0.3～0.35mL/min；柱温40～60℃；检测波长252～256nm。本检测方法所提供的超高效液相色谱法高效、灵敏、操作简单，可同时检测出美洲大蠊肠道菌群代谢产物中的上述6种含氮化合物的含量，从而能够为美洲大蠊肠道菌群代谢产物研究奠定基础。该6种含氮化合物5-羟基吲哚啉-2-酮(A)、6-羟基-3,4-二氢-1H-2-喹啉酮(B)、8-羟基-2-喹啉酮(C)、羟吲哚(D)、8-羟基-3,4-二氢-2-喹啉酮(E)、8-羟基-2-喹啉酸(F)的结构式如下所示：在梯度洗脱程序中，流动相A的比例范围是指其在设定时间内、在限定的比例范围内线性变化，如“0～5min，流动相A98％～93％”是指在0～5min内流动相A由98％梯度变化到93％，下同。优选地，所述流动相A为0.10％(v/v)甲酸水溶液。优选地，所述流速为0.3mL/min。优选地，所述柱温为50℃。优选地，所述检测波长为254nm。优选地，上述检测方法包括以下操作：以甲醇水溶液为溶剂，配制所述代谢产物的混合对照品溶液；在所述色谱条件下，用超高效液相色谱法对所述混合对照品溶液进行检测，根据所得峰面积建立各所述代谢产物的浓度–峰面积线性回归方程；以甲醇水溶液为溶剂，将美洲大蠊粪便制成供试品溶液；在所述色谱条件下，用所述超高效液相色谱法对所述供试品溶液进行检测，将得到的峰面积代入所述浓度–峰面积线性回归方程，计算所述供试品溶液中所述代谢产物的含量。优选地，配制所述混合对照品溶液的所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分浓度为30～70％(v/v)。优选地，所述甲醇水溶液中含有0～1％(v/v)甲酸，能够使该检测方法的重复性更好，处理平行样品时，样品RSD更小。优选地，所述供试品溶液的配制方法为：将所述美洲大蠊粪便粉碎，置于相当于所述美洲大蠊粪便重量20～100倍的50～70％(v/v)甲醇水溶液中，超声处理30～50min，过滤，滤液用水稀释至2～3倍。甲醇浓度越高则提取效率越高，但溶剂效应也越明显。选择20～100倍重量的50～70％(v/v)甲醇水溶液为提取溶剂，再以水稀释后，所得色谱峰峰形较佳，溶剂效应消失。过滤时采用常规的0.45μm滤膜即可。优选地，所述甲醇水溶液中含有0～1％(v/v)甲酸。优选地，所述水中含有0～1％(v/v)甲酸。优选地，所述超声的功率为540W，频率为35kHz。优选地，所述制备方法还包括在超声处理前用14000rpm离心10min，取上清液。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中：图1是本专利技术实施例1中供试品溶液的UPLC色谱图；图2是本专利技术实施例1中混合对照品溶液的UPLC色谱图；图中：1为5-羟基吲哚啉-2-酮；2为6-羟基-3,4-二氢-1H-2-喹啉酮；3为8-羟基-2-喹啉酮；4为羟吲哚；5为8-羟基-3,4-二氢-2-喹啉酮；6为8-羟基-2-喹啉酸。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。以下各实施例、检验例中的仪器与试剂如下：AcquityUPLC超高液相色谱仪(美国Waters公司)，配有WatersPDAeλ检测器；ACQUITYHSST3色谱柱(2.1×100mm，1.8μm，美国Waters公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；ME204万分之一电子天平、MS105DU十万分之一电子天平(瑞士Mettlertoledo公司)；DL720B超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；Centrifuge5424R台式高速离心机(德国Eppendorf公司)。5-羟基吲哚啉-2-酮、6-羟基-3,4-二氢-1H-2-喹啉酮、8-羟基-2-喹啉酮、羟吲哚、8-羟基-3,4-二氢-2-喹啉酮、8-羟基-2-喹啉酸对照品(纯度≥95％，实验室自制)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Sigma公司)；甲酸(色谱纯，上海阿拉丁生化科技有限公司)；实验用水为超纯水。美洲大蠊粪便样品取自云南腾药制药股份有限公司石头山美洲大蠊GAP养殖基地，饲养条件严格按照GAP标准执行，饲料主要成分为豆粉。收集成虫期美洲大蠊粪便储存于-20℃冰箱中。实施例1本专利技术实施例提供了一种美洲大蠊肠道菌群含氮代谢产物的检测方法，包括如下步骤：1、对照品溶液制备分别称取适量5-羟基吲哚啉-2-酮、6-羟基-3,4-二氢-1H-2-喹啉酮和8-羟基-2-喹啉酮置于容量瓶中，以70％(v/v)甲醇水溶液(含0.5％(v/v)甲酸)为溶剂，分别配制5-羟基吲哚啉-2-酮、6-羟基-3,4-二氢-1H-2-喹啉酮和8-羟基-2-喹啉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种美洲大蠊肠道菌群代谢产物的检测方法，其特征在于，所述代谢产物包括5-羟基吲哚啉-2-酮、6-羟基-3,4-二氢-1H-2-喹啉酮、8-羟基-2-喹啉酮、羟吲哚、8-羟基-3,4-二氢-2-喹啉酮、8-羟基-2-喹啉酸；所述检测方法为超高效液相色谱法，色谱条件为：/n色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；/n流动相A为0.08～0.12％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：0～5min，流动相A 98％～93％；5～9min，流动相A 93％～90％；9～19min，流动相A 90％～78％；19～20min，流动相A 78％～98％；/n流速0.3～0.35mL/min；/n柱温40～60℃；/n检测波长252～256nm。/n

【技术特征摘要】
1.一种美洲大蠊肠道菌群代谢产物的检测方法，其特征在于，所述代谢产物包括5-羟基吲哚啉-2-酮、6-羟基-3,4-二氢-1H-2-喹啉酮、8-羟基-2-喹啉酮、羟吲哚、8-羟基-3,4-二氢-2-喹啉酮、8-羟基-2-喹啉酸；所述检测方法为超高效液相色谱法，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A为0.08～0.12％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：0～5min，流动相A98％～93％；5～9min，流动相A93％～90％；9～19min，流动相A90％～78％；19～20min，流动相A78％～98％；
流速0.3～0.35mL/min；
柱温40～60℃；
检测波长252～256nm。


2.根据权利要求1所述的美洲大蠊肠道菌群代谢产物的检测方法，其特征在于，所述流动相A为0.10％(v/v)甲酸水溶液。


3.根据权利要求1所述的美洲大蠊肠道菌群代谢产物的检测方法，其特征在于，所述流速为0.3mL/min；和/或
所述柱温为50℃；和/或。
所述检测波长为254nm。


4.根据权利要求1～3任一项所述的美洲大蠊肠道菌群代谢产物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下操作：
以甲醇水溶液为溶剂，配制所述代谢产物的混合对照品溶液；在所述色谱条件下，用超高效液相色谱法对所述混合对照品溶液进行检测，根据所得峰面积建立各所述代谢产物的浓度–峰面积线性...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃飞，吕伟奇，柴欣，薛根，王子延，牛璐，刘香月，杨静，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：天津;12