测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法技术

本发明专利技术公开了一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC‑MS/MS方法，包括以下步骤：储备液的制备；将各储备液稀释成苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液和柳胺酚工作液；校正标准品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；控样品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；样品的检测分析。本发明专利技术所述的方法，具有快捷性、灵敏度高、精密度和准确度良好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应的优点。

【技术实现步骤摘要】
测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法
本专利技术涉及了临床血药浓度监测控制
，具体的是一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法。
技术介绍
肝纤维化是肝病中的一种。人体患有肝纤维化后，容易出现疲乏无力、食欲减退等症状，可能还会出现慢性消化不良、出血等症状，这些症状会给人体造成很大伤害。扶正化瘀片是常用的治疗肝纤维化的中成药之一，其主要成分包括：五味子醇甲(Schisandrin)、五味子乙素(γ-Schisandrin)、马索亚内酯(MassoiaLactone)、丹参素钠(SodiumDanshensu)、野黑樱苷(Prunasin)、苦杏仁苷(Amygdalin)、柚皮素(Naringenin)、槲皮素(Quercetin)、芦丁(Rutin)、商陆苷(Ombuoside)及其代谢产物商陆素(Ombuin)、槲皮苷(Quercitrin)、山奈酚(Kaempferol)、葵烯酸钠(Sodium5-Hydroxy-2-Decenoic)。检测比格犬(Beagle犬)血浆中扶正化瘀片的毒代动力学特征，评估药物主要成分在比格犬体内的暴露水平，对于帮助了解药物在人体内的作用效果具有重要意义。因此，本领域技术人员持续致力于研究测定血浆中扶正化瘀片主要成分浓度的HPLC-MS/MS方法。
技术实现思路
为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术实施例提供了一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法，其检测时间短、灵敏度高、定量准确。本申请实施例公开了：一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法，所述方法中采用柳胺酚作为内标，所述方法包括以下步骤：储备液的制备：用HPLC甲醇作为溶剂，配置得到苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液以及柳胺酚储备液；工作液的制备：用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液分别配置，获得苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液；用HPLC甲醇作为溶剂，将所述柳胺酚储备液制备成柳胺酚工作液，所述柳胺酚工作液中的柳胺酚浓度为50ng/mL；校正标准品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；质控样品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；样品的检测分析：取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；将各上清液进行稀释，然后进样分析。具体的，所述方法中，液相色谱参数如下：色谱柱：InertstainAQ-C182.1*50mm，5μm，柱温为40℃；流动相：所述流动相的体积为500μL，包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：乙酸体积分数为0.2％的乙酸水溶液，所述流动相B为：乙酸体积分数为0.2％的乙酸甲醇溶液；质谱条件：采用电喷雾离子原，负离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：苦杏仁苷的母离子/特征子离子的检测离子对为456.2/323.1，柚皮素的母离子/特征子离子的检测离子对为271.1/151.2，槲皮素的母离子/特征子离子的检测离子对为301.1/151.1，柳胺酚的母离子/特征子离子的检测离子对为228.1/210.0。具体的，流动相梯度洗脱条件为：第0.01～0.1min，所述流动相A的体积分数为85％；第0.5min，所述流动相A的体积分数为60％；第1min，所述流动相A的体积分数为20％；第2～3min，所述流动相A的体积分数为0；第3.01～3.40min，所述流动相A的体积分数为50％；第3.41～4.50min，所述流动相A的体积分数为0；第4.51～5.80min，所述流动相A的体积分数为85％。具体的，所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液中，苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素的浓度分别介于100ng/mL～100000ng/mL之间。具体的，所述校正标准品中，所述苦杏仁苷、柚皮素和槲皮素的浓度分别介于5.0～5000ng/mL之间。具体的，所述质控样品中，所述苦杏仁苷、柚皮素和槲皮素的浓度分别介于5.0～3750ng/mL之间。具体的，对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用的条件包括：在10℃，4000rpm条件下离心10min。具体的，所述空白血浆为比格犬血浆。本专利技术至少具有如下有益效果：本方法具有快捷性、灵敏度高、精密度和准确度良好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应的优点。为让本专利技术的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例中所述溶剂样品中苦杏仁苷的质谱图；图2是本专利技术实施例中所述溶剂样品中柚皮素的质谱图；图3是本专利技术实施例中所述溶剂样品中槲皮素的质谱图；图4是本专利技术实施例中所述第二空白样品中苦杏仁苷的质谱图；图5是本专利技术实施例中所述第二空白样品中柚皮素的质谱图；图6是本专利技术实施例中所述第二空白样品中槲皮素的质谱图；图7是本专利技术实施例中所述第一空白样品中苦杏仁苷的质谱图；图8是本专利技术实施例中所述第一空白样品中柚皮素的质谱图；图9是本专利技术实施例中所述第一空白样品中槲皮素的质谱图图10是本专利技术实施例中所述质控样品5中苦杏仁苷的质谱图；图11是本专利技术实施例中所述质控样品5中柚皮素的质谱图；图12是本专利技术实施例中所述质控样品5中槲皮素的质谱图图13是本专利技术实施例中残留效应中苦杏仁苷的质谱图；图14是本专利技术实施例中残留效应中柚皮素的质谱图；图15是本专利技术实施例中残留效应中槲皮素的质谱图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本实施例的仪器如下：ShimadzuLC-30AD高效液相色谱仪自动进样器，自动进样器的温度采用15℃柱温箱试药：苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素、柳胺酚、HPLC甲醇、去离子化纯净水、分析纯级乙酸一、储备液的制备：...

【技术保护点】
1.一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述方法中采用柳胺酚作为内标，所述方法包括以下步骤：/n储备液的制备：用HPLC甲醇作为溶剂，配置得到苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液以及柳胺酚储备液；/n工作液的制备：用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液分别配置，获得苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液；用HPLC甲醇作为溶剂，将所述柳胺酚储备液制备成柳胺酚工作液，所述柳胺酚工作液中的柳胺酚浓度为50ng/mL；/n校正标准品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；/n质控样品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；/n样品的检测分析：取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；将各上清液进行稀释，然后进样分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述方法中采用柳胺酚作为内标，所述方法包括以下步骤：
储备液的制备：用HPLC甲醇作为溶剂，配置得到苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液以及柳胺酚储备液；
工作液的制备：用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液分别配置，获得苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液；用HPLC甲醇作为溶剂，将所述柳胺酚储备液制备成柳胺酚工作液，所述柳胺酚工作液中的柳胺酚浓度为50ng/mL；
校正标准品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；
质控样品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；
样品的检测分析：取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；将各上清液进行稀释，然后进样分析。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，液相色谱参数如下：
色谱柱：InertstainAQ-C182.1*50mm，5μm，柱温为40℃；
流动相：所述流动相的体积为500μL，包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：乙酸体积分数为0.2％的乙酸水溶液，所述流动相B为：乙酸体积分数为0.2％的乙酸甲醇溶液；
质谱条件：采用电喷雾离子原，负离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：王樱桃，滕馨莹，
申请(专利权)人：安领生物医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32