一种辣椒素类物质的电化学免疫传感器检测方法及应用技术

一种辣椒素类物质的电化学免疫传感器检测方法及应用，涉及一种新的检测血清的生物传感器制备方法。本发明专利技术分别利用电沉积和滴涂技术的方式将普鲁士蓝‑纳米金、硫堇和辣椒素类物质抗体依次修饰在玻碳电极表面。包括以下步骤：普鲁士蓝用含一定浓度醋酸的壳聚糖充分溶解，然后加入一定量金纳米粒子充分混匀制备沉积液；经过电流‑时间电化学处理技术将混合溶液电沉积在电极表面；另外，在修饰好的电极表面滴加硫堇，可以加快电子传递速率的同时增强电极的稳定性从而提高传感器电信号。本发明专利技术免疫传感器稳定性好、选择性优、灵敏度高，可用于血清样品中辣椒素类物质的快速检测。

Detection of capsaicin by electrochemical immunosensor and its application

【技术实现步骤摘要】
一种辣椒素类物质的电化学免疫传感器检测方法及应用
本专利技术涉及一种辣椒素类物质的电化学免疫传感器检测方法及其在血清鉴别中的应用，属于医学、免疫分析、电化学生物传感器领域。
技术介绍
辣椒素（反-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺）是辣椒果实中引起辣味口感的主要成分，它是衡量辣椒品质和确定品种间差异的一个重要指标；除此以外，近年来对于辣椒素其他功能的研究较为丰富，例如辣椒素具有长效镇痛作用，人和动物内服或局部使用辣椒素都显示其对伤害性热和化学品刺激所引起的疼痛有明显的失敏作用；辣椒素可以抑制胃酸的分泌，从而促进碱性黏液的分泌，降低胃内酸浓度，对于乙醇、阿斯匹林以及各种应激所致的胃黏膜损伤有着明显的保护作用；此外，还有报道指出，辣椒素曾作为兴奋剂的主要成分，被用于赛马等国际赛事中，引起恶劣影响；因此，在辣椒素的抗菌消炎、镇痛止痒、促进脂肪代谢、防治风湿与肿瘤等药用功效以及兴奋剂检测的研究中，均会涉及辣椒素在血液中浓度的测定，因此准确、高灵敏的检测血清中辣椒素含量至关重要现有辣椒素的检测方法有气相色谱法、光谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法、免疫分析法等；液相色谱法是检测辣椒素比较普遍的一种方法，但是在做液相色谱时对于试验仪器的要求比较高，而且耗费时间长，需要工作人员花费大量时间调试仪器，当仪器调试完毕后，最佳检测期短，对于工作人员和仪器都是很大考验，而且在试验过程中，对比样品要求苛刻，再加上血清样品基质复杂，对试验过程中制作参考依据提出来考验，需要耗费大量人力物力，成本比较高昂；而我们需要一种能够快速检测，适应性强，操作简便，特异性强的方法，近几年来兴起的电化学免疫传感器能够很好的满足我们的要求。电化学分析，以其广泛的高灵敏度高精度测量仪器和设备简单，价格低廉等优点，被广泛应用于生命科学的环境能源出入境检疫、食品安全等领域的公共安全监控测试；电化学检测的关键是产生高灵敏度、高强度的信号；因此，不同金属离子对电信号的放大效应引起了广泛的关注，如Au3+、Ag2+等；但现有的电化学传感器检测辣椒素普遍存在电信号不稳定的缺点，如果能够利用抗原抗体特异性结合的原理制备一种能够特异性检测辣椒素的免疫传感器，将为辣椒素的检测开辟一条新的途径，也为免疫传感器的制备提供一种新方法。普鲁士蓝是一种特殊的亚铁氰化物(Fe4[I][FeII(CN)6]4)，由于其独特的电化学和电催化性能及高活性，被广泛用作传感器的介质；纳米金颗粒具有独特的导电性、生物相容性和光学性质，可用于生物组分的高灵敏度检测，是目前研究最广泛的纳米材料之一；硫堇稳定性好，易于聚合，加速了电子的转移，进一步提高了传感器的灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对传统方法试验成本高、操作时间长的问题，提供一种制备简单、稳定性高、选择性好的电化学免疫传感器，并用于辣椒素、合成辣椒素、二氢辣椒素三种辣椒素类物质的检测；基于硫堇/普鲁士蓝-纳米金纳米复合物制备的双重放大信号免疫传感器，使得该方法拥有灵敏度高、线性范围宽、成本低等优良分析性能，具有制备工艺简单、灵敏度好、检测时间短等优点，在血清中的辣椒素类物质检测领域中具有很好的实用前景。本专利技术的技术方案为：普鲁士蓝和金纳米粒子通过电沉积技术修饰在玻碳电极表面，辣椒素类物质抗体、硫堇通过滴涂偶联在在已修饰了普鲁士蓝-纳米金的电极表面，实现电化学免疫传感器的构建，包括如下步骤（1）普鲁士蓝-纳米金复合材料的制备首先将50mL0.01wt%四氯金酸溶液在磁性搅拌机搅拌下加热至沸点，然后迅速加入2.5mL1wt%的柠檬酸钠溶液，当混合物变成深红色时，继续大力搅拌，煮沸15分钟，然后继续搅拌，冷却至室温，4℃避光存放；称取0.1g壳聚糖，溶于200mL1.0%乙酸溶液中，室温下搅拌3小时，使壳聚糖完全溶解后，将0.0625gFeCl3、0.0822gK3[Fe(CN)6]、0.7455gKCl和1mL浓盐酸分别加入上述壳聚糖溶液100mL中，超声分散至得到深绿色分散体；最后向混合溶液中加入1mL制备好的纳米金，并用超声波在室温下分散0.5小时，直至完全溶解，即可得到普鲁士蓝-纳米金复合材料（2）硫堇溶液的制备首先称取100mg硫堇粉末，将其放入烧杯中，然后加入超纯水搅拌溶解定容至25mL，得到4mg/mL的硫堇溶液（3）辣椒素类物质电化学免疫传感器的制备首先，将预处理好的玻碳电极浸入普鲁士蓝-纳米金复合材料溶液中，通过电沉积的方式使其固定在电极表面，然后，在普鲁士蓝-纳米金复合材料层滴加5μL硫堇溶液，室温组装；将组装好的电极浸入1mL97.7ng/mL辣椒素类物质抗体溶液中，4℃孵育过夜；用pH=7.5的磷酸盐缓冲液冲洗干净后，继续滴加5μL质量分数为0.5%的BSA，室温封闭40分钟；将所得电极用pH=7.5的磷酸盐缓冲液冲洗干净，晾干，即可得到所制备的电化学免疫传感器。辣椒素类物质电化学免疫传感方法，包括以下步骤（1）辣椒素类物质电化学免疫传感器的制备首先将50mL0.01wt%四氯金酸溶液在磁性搅拌机搅拌下加热至沸点，然后迅速加入2.5mL1wt%的柠檬酸钠溶液，当混合物变成深红色时，继续大力搅拌，煮沸15分钟，然后继续搅拌，冷却至室温，4℃避光存放；称取0.1g壳聚糖，溶于200mL1.0%乙酸溶液中，室温下搅拌3小时，使壳聚糖完全溶解后，将0.0625gFeCl3、0.0822gK3[Fe(CN)6]、0.7455gKCl和1mL浓盐酸分别加入上述壳聚糖溶液100mL中，超声分散至得到深绿色分散体；最后向混合溶液中加入1mL制备好的纳米金，并用超声波在室温下分散0.5小时，直至完全溶解，即可得到普鲁士蓝-纳米金复合材料；将预处理好的玻碳电极浸入普鲁士蓝-纳米金复合材料溶液中，通过电沉积的方式使其固定在电极表面；称取100毫克硫堇粉末，将其放入烧杯中，然后加入超纯水搅拌溶解定容至25mL，得到4mg/mL的硫堇溶液；在普鲁士蓝-纳米金复合材料层滴加5μL硫堇溶液，室温组装；将组装好的电极浸入适合浓度的辣椒素类物质抗体溶液中，4℃孵育过夜；用pH=7.5的磷酸盐缓冲液冲洗干净后，继续滴加5μL质量分数为0.5%的BSA，室温封闭40分钟；将所得电极用pH=7.5的磷酸盐缓冲液冲洗干净，晾干，即可得到所制备的电化学免疫传感器（2）标准溶液中辣椒素类物质的检测向步骤（1）制备的辣椒素类物质电化学免疫传感器表面滴加5μL不同浓度的辣椒素标准溶液，室温下温育反应40分钟后采用pH=7.5的磷酸盐缓冲液冲洗干净，在5mM铁氰化钾溶液中，用差分脉冲伏安法记录电流响应值，从而检测出标准溶液中辣椒素类物质的含量。本专利技术还提供了一种基于辣椒素类物质的电化学免疫传感器的所建立的电化学免疫传感方法在血清检测中应用，包括以下步骤首先，取Balb/c小鼠血浆盛于离心管中，置于37℃环境中促其凝固，待血液凝固后离心（3000rpm/5min），得到血清样品，每个样品分别进行五个平行试验；向制备的辣椒素类物质电化学免疫传感器表面滴加5μL不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种辣椒素类物质的电化学免疫传感器，其特征在于，通过将普鲁士蓝-纳米金和硫堇先后分别以电沉积和滴涂的方式修饰在玻碳电极表面来增强电极的导电性和固定辣椒素类物质抗体，后用BSA封闭非特异性位点，实现传感器的构建，包括如下步骤/n（1）玻碳电极预处理：首先将裸玻碳电极在0.3 μm氧化铝泥浆中进行抛光至镜面，然后将其先后在超纯水和无水乙醇中分别超声1分钟并用氮气吹干，最后将玻碳电极在浓度为5mM铁氰化钾溶液中，用循环伏安法测定其电位差小于80 mV，4℃保存，备用/n（2）制备修饰电极：首先将普鲁士蓝-纳米金复合材料通过电沉积的方式固定在电极表面，后将制备好的硫堇溶液滴涂在电极表面，室温干燥，制得修饰电极/n（3）固定抗体：将步骤（2）制得的电极浸入适合浓度的辣椒素类物质抗体溶液中，4℃孵育过夜，使辣椒素类物质抗体固定在硫堇/普鲁士蓝-纳米金复合材料层/n（3）滴涂BSA封闭液以封闭电极表面非特异性结合位点，冲洗并吹干，制得所述辣椒素类物质的电化学免疫传感器。/n

【技术特征摘要】
1.一种辣椒素类物质的电化学免疫传感器，其特征在于，通过将普鲁士蓝-纳米金和硫堇先后分别以电沉积和滴涂的方式修饰在玻碳电极表面来增强电极的导电性和固定辣椒素类物质抗体，后用BSA封闭非特异性位点，实现传感器的构建，包括如下步骤
（1）玻碳电极预处理：首先将裸玻碳电极在0.3μm氧化铝泥浆中进行抛光至镜面，然后将其先后在超纯水和无水乙醇中分别超声1分钟并用氮气吹干，最后将玻碳电极在浓度为5mM铁氰化钾溶液中，用循环伏安法测定其电位差小于80mV，4℃保存，备用
（2）制备修饰电极：首先将普鲁士蓝-纳米金复合材料通过电沉积的方式固定在电极表面，后将制备好的硫堇溶液滴涂在电极表面，室温干燥，制得修饰电极
（3）固定抗体：将步骤（2）制得的电极浸入适合浓度的辣椒素类物质抗体溶液中，4℃孵育过夜，使辣椒素类物质抗体固定在硫堇/普鲁士蓝-纳米金复合材料层
（3）滴涂BSA封闭液以封闭电极表面非特异性结合位点，冲洗并吹干，制得所述辣椒素类物质的电化学免疫传感器。


2.根据权利要求1所述的一种辣椒素类物质的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括一下步骤
（1）普鲁士蓝-纳米金复合材料的制备
首先将50mL0.01wt%四氯金酸溶液在磁性搅拌机搅拌下加热至沸点，然后迅速加入2.5mL1wt%的柠檬酸钠溶液，当混合物变成深红色时，继续大力搅拌，煮沸15分钟，然后继续搅拌，冷却至室温，4℃避光存放；称取0.1g壳聚糖，溶于200mL1.0%乙酸溶液中，室温下搅拌3小时，使壳聚糖完全溶解后，将0.0625gFeCl3、0.0822gK3[Fe(CN)6]、0.7455gKCl和1mL浓盐酸分别加入上述壳聚糖溶液100mL中，超声分散至得到深绿色分散体；最后向混合溶液中加入1mL制备好的纳米金，并用超声波在室温下分散0.5小时，直至完全溶解，即可得到普鲁士蓝-纳米金复合材料
硫堇溶液的制备
首先称取100mg硫堇粉末，将其放入烧杯中，然后加入超纯水搅拌溶解定容至25mL，得到4mg/mL的硫堇溶液
辣椒素类物质电化学免疫传感器的制备
首先，将预处理好的玻碳电极浸入普鲁士蓝-纳米金复合材料溶液中，通过电沉积的方式使其固定在电极表面，然后，在普鲁士蓝-纳米金复合材料层滴加5μL硫堇溶液，室温组装；将组装好的电极浸入1mL97.7ng/mL辣椒素类物质抗体溶液中，4℃孵育过夜；用pH=7.5的磷酸盐缓冲液冲洗干净后，继续滴加5μL质量分数为0.5%的BSA，室温封闭40分钟；将所得电...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨青青，赵庆雪，孙霞，郭业民，张妍妍，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东;37