一种谷瘟病菌PCR检测引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种谷瘟病菌PCR检测引物组及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术根据谷瘟病菌的ITS基因序列设计了一对PCR特异性扩增引物：上游引物Gw‑15’‑GAAAAACTCCAACCCCTGTGA‑3’；下游引物Gw‑2 5’‑TGCGTCCAAAGATTCGATGA‑3’。通过PCR扩增可以在谷瘟病菌及被谷瘟病菌侵染后的植株组织中扩增出特异性的225bp条带。该特异性检测引物及检测方法可应用于谷子生产中谷瘟病菌侵染后植株中病原菌的快速检测，同时可对大田中谷瘟病的发生提供早期诊断，从而制定相应的病害预警，其具有非常好的应用前景。

PCR primer set for detection of grisea pestis and its application

【技术实现步骤摘要】
一种谷瘟病菌PCR检测引物组及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种谷瘟病菌PCR检测引物组及其应用。
技术介绍
谷子起源于我国，营养丰富，抗旱耐瘠，是我国北方广大干旱地区的优质抗旱作物，再加上谷草是牛羊的优质饲草，在耕地紧缺的情况下是发展畜牧养殖业的首选粮草兼用性作物。谷瘟病是由灰梨孢菌(Magnaportheoryzae)引起的的一种谷子暴发流行性真菌病害，全生育期均可发病，特别是后期的穗瘟对产量影响较大，严重发生可导致绝产。近几年，随着规模化种植及耕作条件的改变，谷瘟病已经成为影响我国谷子生产的重要病害之一，这对我国谷子产业的健康发展形成了严重的威胁。由于目前生产中缺乏抗病品种，另外谷瘟病菌生理小种频繁变异，导致该病害非常难控制。生产中最常用的是利用化学农药防治谷瘟病，但是该病害潜伏期短流行速度快，田间发现病害后往往很难进行防治，防治效果不佳。另外田间还有许多叶斑类病害，有的与谷瘟病斑类似，许多技术人员无法对其病原进行准确鉴定，还需要到实验室分离培养，鉴定需要较长时间，往往错过最佳防治时机。因此生产中急需谷瘟病的早期诊断技术。近年来随着分子生物学技术的发展，PCR技术广泛应用于植物病原真菌检测中。如王楠等在谷子上建立了谷锈菌的巢式PCR检测体系，可对谷子中谷锈菌进行特异检测。王志荣等通过RT-PCR技术对番茄中褪绿病毒进行了快速检测。因此利用PCR技术对谷瘟病的检测，可应用于谷瘟病原准确鉴定及病害早期发现，可为病害防控节省宝贵时间，对提高化学防控的防治效果有很大帮助。专利技术内容为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种谷瘟病菌PCR检测引物组及其应用。目前传统的谷瘟病菌分离及显微形态鉴定的周期长，延误病害防治最佳时期，同时还需要具有丰富植物病原菌分离鉴定经验的技术人员。本专利技术通过PCR检测技术对谷瘟病原进行精准鉴定，另外还可以对谷子叶片中的谷瘟病菌进行早期检测。为达上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：本专利技术提供了一种谷瘟病菌PCR检测引物组，该引物组包括核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的上游引物和如SEQIDNo.5所示的下游引物，该特异性PCR引物组获得的方法包括如下步骤：(1)提取谷瘟病菌基因组DNA；(2)利用真菌ITS通用引物ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3(即SEQIDNo.1)和ITS45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(即SEQIDNo.2)，以谷瘟病菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，可获得543bp的特异性片段；(3)把步骤(2)中回收纯化后的543bp的特异性片段连接到PMD19-T载体中；(4)通过氯化钙介导的转化方法把连接产物转入到大肠杆菌JM109感受态细胞中，利用通用引物ITS1和ITS4进行菌落PCR，检测阳性克隆，把阳性克隆送北京中科希林公司测序，测序分析去除载体序列后即得谷瘟病菌ITS的特异片段核苷酸碱基序列，如序列表中SEQIDNo.3所示；(5)谷瘟病菌特异性PCR引物设计：根据谷瘟病菌核糖体ITS序列结果，利用BioXM2.6软件设计了特异性引物序列，具体包括上游引物Gw-15’-GAAAAACTCCAACCCCTGTGA-3’(即SEQIDNo.4)和下游引物Gw-25’-TGCGTCCAAAGATTCGATGA-3(即SEQIDNo.5)。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：利用PCR技术可以对谷瘟病菌进行快速检测，该引物特异性好，不受谷子上其它常见植物病原真菌影响。谷瘟接种后1天后虽然叶片中病菌非常少，但是该方法可以检测到该病菌，可为谷瘟病菌病害的发生提供早期预警。早期防治后用药少，防治效果明显，该引物在谷瘟病害预测预报中有非常好的应用前景。附图说明图1为实施例1中PCR扩增产物电泳图。图2为实施例2中PCR扩增产物电泳图。图3为实施例3中PCR扩增产物电泳图。具体实施方式实施例1本实施例对SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示的PCR引物组的特异性进行检测，步骤如下：(1)谷子上常见真菌DNA的提取，包括谷瘟病菌以及谷子上其它常发生性6种植物病原真菌，分别为谷瘟(Magnaportheoryzae)、谷子白发(Sclerosporagraminicola)、谷子纹枯(Rhizoctoniasolani)、粟黑穗菌(Ustilagocrameri)、谷子大斑菌(Bipolarissetariae)、粟弯孢霉(Curvularialunata)、谷锈病(Uromycessetariae-italicae)，详细步骤如下：a.对谷瘟病菌、谷子纹枯病菌、谷子大斑病菌和粟弯孢霉病菌在固体PDA活化后，挑取菌盘接种到液体PDA培养基中，培养七天后收集菌丝，用灭菌滤纸压干后用于提取基因组DNA。谷锈菌和黑穗病菌直接用孢子粉提取DNA，而白发病菌用其卵孢子提取DNA。b.谷子上病原菌采取CTAB提取基因组DNA。具体步骤为：①取200mg的菌丝体或孢子粉，放入研钵中，液氮研磨至粉末状，把研磨好的样品放入到已在液氮中预冷的1.5ml离心管中，每管约0.1g；②加入400μL裂解缓冲液(100mMTris-HCl,20mMEDTA,1.4MNaCl,2％CTAB)，65℃水浴40min，每10min颠倒混匀一次；③室温冷却后加入400μL苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1)，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心10min；④吸取上清，转移至新离心管中，加入1/10体积的CTAB-NaCl轻轻混匀，取等体积苯酚/氯仿/异戊醇轻轻混匀，4℃、12000rpm离心10min。⑤吸取上清后转移至新离心管中，再加入等体积的冰冻异丙醇沉淀DNA，轻轻混匀，置于-20℃，15-30min后，4℃12000rpm离10min。⑥倒掉上清，加入1ml70％乙醇洗涤沉淀2次，沉淀晾干后加入50-100μLTE，37℃过夜，取出放-20℃保存。(2)以步骤(1)中7种基因组DNA为模板，SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示核苷酸序列为引物，分别进行PCR扩增，反应体系为25μL，其中DNA模板2.0μL，上游引物Gw-10.5μL，下游引物Gw-20.5μL，2×EsTaqMasterMix12.5μL，ddH...2...O9.5μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸10min。PCR扩增产物电泳后结果如图1所示，其中M：DNAMaker2000；泳道1-2：谷瘟病菌(Magnaportheoryzae)；泳道3：谷子白发病菌(Sclerosporagraminicola)；泳道4：谷子纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)；泳道5：粟黑穗病菌(Ustilagocrameri)；泳道6：谷子大斑病菌(Bipolarissetariae)；泳道7：粟弯孢霉病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种谷瘟病菌PCR检测引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示的上游引物和如SEQ ID No.5所示的下游引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种谷瘟病菌PCR检测引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的上游引物和如SEQIDNo.5所示的下游引物。


2.根据权利要求1所述的谷瘟病菌PCR检测引物组在农作物谷瘟病菌检测中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示的核苷酸序列为引物组进行PCR；
(3)对PCR扩增产物进行检测。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中采用改良的CTAB法对样本基因组DNA进行提取。


5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中采用的PCR反应体系为25μL，其中DNA模板2.0μL，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志勇，白辉，王璐，王永芳，董志平，马继芳，刘磊，全建章，
申请(专利权)人：河北省农林科学院谷子研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13