同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物、试剂盒及方法技术

本申请公开一种同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物组、试剂盒及方法，引物组包括：第一上游引物：5'‑ATGAAAAAGAGTACTCTGGC‑3'；第一下游引物：5'‑TCAGAACTGGTAGGTCATGCC‑3'；第二上游引物：5'‑CGCGGATCCATGCAAGATTCAATAGCGGTG‑3'；第二下游引物：5'‑CCGCTCGAGTTATTTAGCTTCGAAATAAAC‑3'。提取待测样品的DNA，以所提取的DNA为模板、采用所述的特异性引物组进行双重PCR，若扩增结果中同时在1053bp和1401bp处扩增出条带，则判定待测样品中含有肺炎克雷伯菌和金黄杆菌。本申请可同步PCR快速检测方法，该方法具有操作简单，快速，灵敏度高，操作简单，结果明辨，易推广。

Specific primers, kits and methods for simultaneous detection of Klebsiella pneumoniae and aureobacteria from Pseudosciaena crocea

【技术实现步骤摘要】
同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物、试剂盒及方法
本申请属于微生物检测
，具体涉及一种同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物、试剂盒及方法。
技术介绍
肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌属(Klebsiella)，是分布广泛且危害严重的条件性致病菌之一，主要存在于人和动物的肠道、呼吸道、泌尿生殖道。当宿主免疫力低下或长期服用抗生素导致机体菌群失调的情况下，该菌可“趁虚而入”引发一系列疾病，如肺炎、脑膜炎、肝脓肿、泌尿系统炎症、伤口感染和全身败血症等。由于兽用抗生素的滥用导致该菌耐药率的显著上升，给该病的治疗带来了很大的挑战。国内研究人员先后从牛、梅花鹿、水貂、猪以及水生生物鲤鱼、对虾和水禽等动物体内分离到该菌，说明该菌的感染宿主之多，流行范围之广，其发病后可增加宿主对其他病原的易感性，严重时引起死亡。肺炎克雷伯杆菌为革兰氏阴性菌，呈单个或成双的短杆状，菌体两极染色，无鞭毛，无芽孢，但有较厚的荚膜。金黄杆菌属(Chryseobacleriunz)是一个新近命名的菌属，无鞭毛，无芽孢，严格好氧生长的一类菌革兰氏阴性属，呈短小杆状。其广泛分布于水体、土壤和环境中，是一种常见的条件性致病菌。金黄杆菌属由原先的6个种和3个新种构成，包括脑膜炎败血性金黄杆菌(C.meningosepticum)、产吲哚金黄杆菌(C.indologenes),黏金黄杆菌(C.gleum)、大比目鱼金黄杆菌(C.balustinum)、大菱鲆金黄杆菌(C.scophthalmum)。金黄杆菌属既可导致外源性感染，又能因宿主免疫力低下和抗生素滥用等引起内源性感染。金黄杆菌虽为条件性致病菌但其感染宿主范围非常广泛包括人，畜禽和水动物，其可引起新生儿脑膜炎、败血症及呼吸道感染等疾病的发生，并且先后从发病的牛、鳜鱼、河蟹、鲟、乌鳢、中华鳖、鳗鲡体内分离到该致病菌。值得一提的是，金黄杆菌可引起棘胸蛙发生歪头病，致死率达到100％，说明金黄杆菌对棘胸蛙具有较强的致病性，可造成极大的经济损失。其可与多种条件性致病菌共存并造成混合感染，而且该菌对多种抗生素产生耐药，因此针对该菌的准确诊断、流行病学调查和防控工作显的十分重要。作为“四大海产”之一的大黄鱼，因其肉质鲜嫩，营养丰富深受消费者喜爱，是我国近海重要的经济鱼类。近年来，随着集约化养殖程度的加快和人工养殖密度的增加，加上管理水平的参差不齐和渔药的不规范使用，引起大黄鱼抵抗力降低或者正常菌群的失调，导致易感染条件性致病菌肺炎克雷伯菌和金黄杆菌。病鱼表现出行动迟缓、不合群、进食障碍、腹部胀气、鳃丝溃烂，体表有出血性溃疡斑、患鱼抵抗力下降，从而增加对弧菌和刺激隐核虫等病原的易感性，当前临床多为混合感染病例，而且肺炎克雷伯菌和金黄杆菌为分布及其广泛的条件性致病菌。传统的病原菌检测方法是病原菌的形态学观察和细菌的生理生化特征进行鉴定，存在耗时长和结果误判的可能。通过扩增16SrRNA，尚需要借助测序结果才能判定。针对水产动物细菌病原的血清学方法，首先需要对具备优良免疫原性的候选蛋白进行筛选，表达和纯化，免疫接种动物制备血清。该方法操作复杂，耗时长，成本高。荧光定量PCR需要对引物进行特殊的修饰，而且需要借助于昂贵的仪器来完成。
技术实现思路
本申请提供同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物、试剂盒及方法，实现大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的同步快速检测。同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物组，包括：第一上游引物：5'-ATGAAAAAGAGTACTCTGGC-3'；第一下游引物：5'-TCAGAACTGGTAGGTCATGCC-3'；第二上游引物：5'-CGCGGATCCATGCAAGATTCAATAGCGGTG-3'；第二下游引物：5'-CCGCTCGAGTTATTTAGCTTCGAAATAAAC-3'。本申请还提供一种同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的试剂盒，包括所述的特异性引物组。关于试剂盒，以下还提供了若干可选方式，但并不作为对上述总体方案的额外限定，仅仅是进一步的增补或优选，在没有技术或逻辑矛盾的前提下，各可选方式可单独针对上述总体方案进行组合，还可以是多个可选方式之间进行组合。可选的，第一上游引物和第一下游引物的浓度为10μM；第二上游引物和第二上游引物的浓度为10μM。可选的，还包括：10×Buffer、MgCl2、dNTPMixture、Taq酶、灭菌的ddH2O、阳性对照液和阴性对照液。可选的，所述的10×Buffer为2μL；所述的MgCl2为1μL25mM的MgCl2；所述的dNTPMixture为1μL，dNTPMixture的浓度为10mM；所述Taq酶为1μL，Taq酶的酶活为5U/μL；所述的灭菌的ddH2O为1mL。可选的，10μM的第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物和第二下游引物各0.5μL。其中，10×Buffer为50mMTris-Hcl和300mMKCl，pH＝8.0。可选的，所述阳性对照液为提取的肺炎克雷伯菌基因组DNA提取的金黄杆菌基因组DNA；阴性对照液为灭菌水。本申请还提供一种同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的方法，包括：提取待测样品的DNA，以所提取的DNA为模板、采用所述的特异性引物组进行双重PCR，若扩增结果中同时在1053bp和1401bp处扩增出条带，则判定待测样品中含有肺炎克雷伯菌和金黄杆菌。可选的，所述双重PCR的体系为：10×Buffer2μL，25mMMgCl21μL，dNTPMixture(10mM)1μL，10μM/L的两组上、下游引物各0.5μL；Taq酶(5U/μL)1μL，DNA模板1μL，灭菌水补齐至25μL。“10μM的两组上、下游引物各0.5μL”是指“10μM的第一组上游引物0.5μL、10μM的第一下游引物0.5μL、10μM的第二组上游引物0.5μL、10μM的第二下游引物0.5μL”，即四个引物总加入量为2μL。可选的，所述双重PCR的反应条件：95℃预变性3min，95℃变性15S，56℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环，72℃继续延伸5min，温度降至4℃，进行保存。本申请目的在于提供针对编码肺炎克雷伯菌的外膜蛋白phoE基因和金黄杆菌外膜蛋白OmpA基因进行特异性检测引物的设计，可同步PCR快速检测方法，该方法具有操作简单，快速，灵敏度高，操作简单，结果明辨，易推广。附图说明图1为使用UniProt在线数据库中的Align软件对不同肺炎克雷伯菌参考株的phoE序列进行比对分析结果图。图2为使用UniProt在线数据库中的Align软件对不同金黄杆菌参考株的OmpA序列进行比对分析结果图。图3为测大黄鱼感染肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的引物特异性双重PCR结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物组，其特征在于，包括：/n第一上游引物：5'-ATGAAAAAGAGTACTCTGGC-3'；/n第一下游引物：5'-TCAGAACTGGTAGGTCATGCC-3'；/n第二上游引物：5'-CGCGGATCCATGCAAGATTCAATAGCGGTG-3'；/n第二下游引物：5'-CCGCTCGAGTTATTTAGCTTCGAAATAAAC-3'。/n

【技术特征摘要】
1.同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物组，其特征在于，包括：
第一上游引物：5'-ATGAAAAAGAGTACTCTGGC-3'；
第一下游引物：5'-TCAGAACTGGTAGGTCATGCC-3'；
第二上游引物：5'-CGCGGATCCATGCAAGATTCAATAGCGGTG-3'；
第二下游引物：5'-CCGCTCGAGTTATTTAGCTTCGAAATAAAC-3'。


2.同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的特异性引物组。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，第一上游引物和第一下游引物的浓度均为10μM；第二上游引物和第二上游引物的浓度均为10μM。


4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：10×Buffer、MgCl2、dNTPMixture、Taq酶、灭菌的ddH2O、阳性对照液和阴性对照液。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的10×Buffer为2μL；所述的MgCl2为1μL25mM的MgCl2；所述的dNTPMixture为1μL，dNTPMix...

【专利技术属性】
技术研发人员：呼高伟，付永前，郑伟龙，吴佳怡，贾强，
申请(专利权)人：台州学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33