PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括用于检测PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对以及用于检测内参基因的第二探针和第二引物对。采用该试剂盒和ddPCR技术相配合可快速准确检测出PTPN22基因的拷贝数，为糖尿病的临床诊断和评估提供参考。

PTPN22 gene copy number variation detection kit and detection method

【技术实现步骤摘要】
PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及基因检测领域，尤其涉及一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
随着生命科学和测序技术的不断发展，从单核苷酸突变到显微镜可见的染色体倒置，越来越多的基因组变异类型被鉴定出来。其中，一种亚显微水平(长度从kb到Mb)的基因结构变异即拷贝数变异(Copynumbervariation，CNV)受到研究者们的广泛关注，包括拷贝数减少、增加、复制和复合多位点的变异。CNV涉及的基因片段较长，往往包含功能基因的编码区或调控区。因此，CNV不仅成为遗传多态性和进化表征的分子基础，而且在人类疾病的发生发展过程中发挥了至关重要的作用。虽然CN102108408A公开了一种用于检测I型糖尿病易感性的试剂盒，该试剂盒包括同时检测PTPN22(蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22)基因的rs2476601位点、CTLA-4的rs231775位点和VDR的rs22285570位点的引物对和特异性延伸探针，通过单核苷酸微阵列分型技术，将I型糖尿病易感人群筛选出来。然而，该试剂盒涉及3个基因的单核苷酸突变，其影响基因序列较小，在评价疾病易感性方面存在一定的局限性。而CNV变异是亚显微水平的基因结构变异，能够影响整个基因编码区或调控区，能够有效检测II型糖尿病的易感性。此外，该专利文献公开的技术方案采用该检测I型糖尿病易感性的试剂盒检测时还需要纯化PCR扩增产物、引物延伸反应、杂交等步骤，操作繁琐。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法，能够快速准确检测PTPN22基因拷贝数变异，为II型糖尿病的临床诊断和评价提供指导。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：本专利技术提供一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，包括用于检测PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对以及用于检测内参基因的第二探针和第二引物对；所述第一探针的序列如SEQIDNO.1所示，且所述第一探针的5’端结合第一荧光基团，3’端结合第一荧光淬灭基团；所述第一引物对的序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；所述内参基因为AP3B1基因，所述第二探针的序列如SEQIDNO.4所示，且所述第二探针的5’端结合第二荧光基团、3’端结合第二荧光淬灭基团；所述第二引物对的序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。在其中一个实施例中，所述第一荧光基团为FAM，第一荧光淬灭基团为MGB。在其中一个实施例中，所述第二荧光基团为HEX，第二荧光淬灭基团为TRMRA。在其中一个实施例中，所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒还包括含DNA聚合酶的混合液。在其中一个实施例中，所述第一引物对和所述第二引物对的浓度为10pmol/μL，所述第一探针和所述第二探针的浓度为4pmol/μL。上述所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒在采用ddPCR检测PTPN22基因拷贝数变异中的应用。本专利技术还提供一种PTPN22基因拷贝数变异检测方法，包括如下步骤：提取模板DNA；利用上述所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒和所述模板DNA制备反应混合液，并将所述混合液上样于芯片中，进行ddPCR反应；将ddPCR反应后的芯片置于数据采集系统上，采集FAM荧光信号和HEX荧光信号；计算FAM荧光信号与HEX荧光信号的比值，即得所述PTPN22基因拷贝数。在其中一个实施例中，所述ddPCR的反应体系为：在其中一个实施例中，所述ddPCR的反应程序为：4℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，72℃再延伸5min，12℃保存。在其中一个实施例中，所述提取模板DNA包括如下步骤：采集抗凝血液置于灭菌离心管，加入磷酸缓冲液混匀，多次离心和再溶解至上清液透明、沉淀呈透明色；向离心管中加入DNA抽提缓冲液，37℃水浴；再加蛋白酶K，混匀，55℃水浴中消化过夜至絮状沉淀不见，得澄清溶液；将所述澄清溶液冷却，加入Tris饱和酚溶液，混匀，离心，将上层水相转入另一灭菌离心管，再加入氯仿，混匀，离心，将上层水相转入另一灭菌离心管，再加入氯仿异戊醇混合液(V氯仿:V异戊醇＝24:1)，混匀，离心，再将上层水相转入另一灭菌离心管，加入预冷无水乙醇使DNA呈絮状沉淀，离心，弃去乙醇，向下层沉积中再加入预冷70％乙醇，离心，多次漂洗DNA沉淀，离心弃上清液，室温下使下层DNA沉积中的乙醇挥发干净；再向下层DNA沉积中加入TE缓冲液溶解DNA，4℃保存，直至DNA完全溶解，得模板DNA。优选地，所述模板DNA的浓度大于50ng/μL。研究发现：蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22(PTPN22)基因存在CNV变异，并且进一步生物信息学统计分析发现PTPN22基因的CNV可能与II型糖尿病的易感性有关相关。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用包括用于检测PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对以及用于检测内参基因的第二探针和第二引物对的试剂盒，可利用ddPCR技术，并根据靶标基因与内参基因的荧光比值，快速检测确定PTPN22基因具体拷贝数目，灵敏度高，特异性好，对于II型糖尿病(尤其是II型糖尿病肾病)的临床诊断与临床评估提供参考。具体实施方式以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。实施例1本实施例提供一种用于检测靶向PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对。其中，用于快速检测靶向PTPN22基因CNV的第一探针(命名为PTPN22-Probe)序列为：TTGGCCAGACCATGATGTACCTTC(SEQIDNo.1)，且该第一探针的5’端结合FAM，3’端结合MGB。用于快速检测靶向PTPN22基因CNV的第一引物对,包括上游引物PTPN22-F和下游引物PTPN22-R:PTPN22-F:CTATCTACCAGTTTCATTACAAGA(SEQIDNo.2)，PTPN22-R:GAGGATGACAGTGTTCCCATATG(SEQIDNo.3)。第一探针和第一引物对送至生物公司合成。值得说明的是，与其它荧光基团修饰第一探针序列相比，本实施例中第一探针的3’端选择MGB修饰时，其杂交能力更强、更加稳定。本实施例中使用的第一探针和第一引物是遵循如下原则筛选得到的，能够特异性鉴定PTPN22基因CNV。具体设计原则如下：(1)探针设计原则①探针位置尽可能地靠近上游引物；②探针长度20-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对以及用于检测内参基因的第二探针和第二引物对；/n所述第一探针的序列如SEQ ID NO.1所示，且所述第一探针的5’端结合第一荧光基团，3’端结合第一荧光淬灭基团；/n所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；/n所述内参基因为AP3B1基因，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.4所示，且所述第二探针的5’端结合第二荧光基团、3’端结合第二荧光淬灭基团；/n所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对以及用于检测内参基因的第二探针和第二引物对；
所述第一探针的序列如SEQIDNO.1所示，且所述第一探针的5’端结合第一荧光基团，3’端结合第一荧光淬灭基团；
所述第一引物对的序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；
所述内参基因为AP3B1基因，所述第二探针的序列如SEQIDNO.4所示，且所述第二探针的5’端结合第二荧光基团、3’端结合第二荧光淬灭基团；
所述第二引物对的序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。


2.根据权利要求1所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，所述第一荧光基团为FAM，第一荧光淬灭基团为MGB。


3.根据权利要求1所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，所述第二荧光基团为HEX，第二荧光淬灭基团为TRMRA。


4.根据权利要求1至3任一项所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，还包括含DNA聚合酶的预混液。


5.权利要求1至4任一项所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒在采用ddPCR检测PTPN22基因拷贝数变异中的应用。


6.一种PTPN22基因拷贝数变异检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取模板DNA；
利用权利要求1至4任一项所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒和所述模板DNA制备反应混合液，并将所述混合液上样于芯片中，进行ddPCR反应；
将ddPCR反应后的芯片置于数据采集系统上，采集FAM荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐瑶，郑潇，李家俊，盛杰，郭辉，龙文林，卓情，张同存，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42