一种UV和SERS同时检测食源性致病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种UV和SERS同时检测食源性致病菌的方法。包括下述步骤：S1将十六烷基三甲溴化铵、氯金酸和硼氢化钠混合后进行第一反应；S2将第一混合液与十六烷基三甲溴化铵、氯金酸、硝酸银和抗坏血酸混合后进行第二反应，收集固体产物并与水混合；S3将第二混合液与适配体DNA、染料、羟胺盐酸盐和氯铂酸混合后进行第三反应，得信号探针和纳米酶溶液；S4将含有纳米磁球的液体与抗体混合，得捕获探针溶液；S5将信号探针和纳米酶溶液、捕获探针溶液和待检测溶液混合后进行测试反应，磁分离后得检测混合液；S6将检测混合液进行SERS检测；S7将检测混合液与TMB溶液、H

A method for simultaneous detection of foodborne pathogens by UV and SERS

【技术实现步骤摘要】
一种UV和SERS同时检测食源性致病菌的方法
本专利技术属于致病菌检测
，具体涉及一种UV和SERS同时检测食源性致病菌的方法检测食源性致病菌的方法。
技术介绍
食源性疾病已成为目前国际上最突出的公共卫生安全问题之一，其中食源性致病菌(如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等)是食品安全的重要影响因素。多种致病菌相互混合存在于食品中，且数量差异较大，难以分离，检测困难。已有检测手段包括分离培养鉴定、聚合酶链式反应法、酶联免疫吸附法、质谱法等，这些检测方法各自具有特色和优势，但在实际样品的快速检测过程中仍然存在这样或那样的局限：如耗时费力、灵敏度不高、分辨率低等。因此，为了提高食源性致病菌检测的精度和效率，建立更为有效的新型致病菌同步快速检测手段具有非常重要的学术价值和现实意义。由于成本低廉，简单实用等优点，基于生物酶纳米材料的比色传感方法用于致病菌的快速检测引起人们的关注。该比色方法利用生物酶的催化活性，能催化底物产生显色反应来传感分子识别，但生物酶不稳定且价格贵，其灵敏度也有待提高。表面增强拉曼散射(SERS)因具有快速、高灵敏优势成为研究热点，SERS与抗体、磁分离等联用技术能够实现食源性致病菌检测，但仍存在纳米探针合成复杂费时且重复性低、抗体价格昂贵且容易失活、部分细菌信号较弱使得检测限较高等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于适配体DNA调控的金纳米棒表面生长铂形成信号探针和纳米酶试剂并用于UV和SERS检测食源性致病菌的方法。通过该方法能够灵敏、准确且快速地检测出待测溶液中是否含有食源性致病菌。为了实现上述目的，该方法包括以下步骤：S1、将十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液混合后进行第一反应，得到第一混合液；S2、将步骤S1得到的所述第一混合液与十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液混合后进行第二反应，收集固体产物；将所述固体产物与水混合，得到第二混合液；S3、将步骤S2得到的所述第二混合液与适配体DNA溶液、染料溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯铂酸溶液混合后进行第三反应，得到用于检测食源性致病菌的SERS信号探针和纳米酶溶液；S4、将含有纳米磁球的液体与食源性致病菌的抗体溶液混合，得到捕获探针溶液；S5、将步骤S3得到的所述用于检测食源性致病菌的SERS信号探针和纳米酶溶液、步骤S4得到的捕获探针溶液和待检测溶液混合后进行测试反应，磁分离后得到食源性致病菌检测混合液；S6、将步骤S5得到的所述食源性致病菌检测混合液进行SERS检测；S7、将步骤S5得到的所述食源性致病菌检测混合液与TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液、H2O2溶液和缓冲液混合，进行UV检测。上述方法步骤S1中，所述第一混合液中，十六烷基三甲溴化铵、氯金酸和硼氢化钠的摩尔比依次为1000：(2-5)：(2-10)，具体可为1000：2：2、1000：5：5。所述第一反应的反应条件为：温度为25-27℃，时间为0.5-3h，具体可为0.5h、1h。上述方法步骤S2中，所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液、第一混合液体和抗坏血酸溶液的体积比为1000：(1-20)：(0.1-2.5)：(2-10)：(1-10)，具体可为1000：10：2：3：10，或1000：15：1.5：5：10。所述第二反应的反应条件为：温度为25-35℃，具体可为27℃、30℃，时间为0.5-3h，具体可为1h、2h；所述固体产物和水的质量比为1：(20-1000)，具体可为1:200、1:250。上述方法步骤S3中，所述适配体DNA序列由调控生长的序列和识别菌的序列组成，其中调控生长的序列可以由10-30个A、T或A和T的混合序列组成，识别菌的序列可以根据所要检测的食源性致病菌的种类进行选取。具体的，所述适配体DNA溶液中的DNA序列为如下1)-3)中任一种：1)序列表中序列1：5′-AAAAAAAAAAAAAAAATCCGTCACACCTGCTCTGTCTGCGAGCGGGGCGCGGGCCCGGCGGGGGATGGTGGTGTTGCTCCCGTAT-3′2)序列表中序列2：5′-AAAAAAAAAAAAAAAGCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3′3)序列表中序列3：5′-AAAAAAAAAAAAAAATATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3′。所述第二混合液、适配体DNA溶液、染料溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯铂酸溶液的体积比为100：(1-8)：(0.05-1)：(0.1-1.5)：(1-10)，具体可为100:2:1:1:5，或100：4：0.5：0.5：10；所述第三反应的条件为：温度为25-27℃，时间为1-4h，具体可为1h、2h。上述方法步骤S4中，所述抗体为生物素标记的抗体；所述纳米磁球为链霉亲和素标记的纳米磁球；所述抗体和纳米磁球通过生物素-链霉亲和素结合。所述含有纳米磁球的液体和食源性致病菌的抗体溶液的体积比为100：(2-5)，具体可为100:2，或100:5；所述食源性致病菌的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。所述纳米磁球的粒径为100-500nm。所述含有纳米磁球的液体中的纳米磁球为磁珠、纳米Fe3O4和/或纳米Fe2O3。上述方法步骤S5中，所述待检测溶液、用于检测食源性致病菌的信号探针和纳米酶溶液和捕获探针溶液的体积比为1：(10-200)：(10-200)，具体可为1:100:100或1:200:200。所述测试反应条件为：温度为25-30℃，时间为0.25-2h，具体可为0.5h、1h；步骤S7中，所述测试混合液、TMB溶液、H2O2溶液和缓冲液的体积比为1：(2-5)：(2-10)：40，具体可为1：2：2：40，或1：5：5：40。可选地，所述十六烷基三甲溴化铵溶液的浓度为0.02-1mol/L，具体可为0.2mol/L、0.6mol/L；所述氯金酸溶液的浓度为0.1-10mol/L，具体可为0.5mol/L、4mol/L；所述硼氢化钠溶液的浓度为1-100mmol/L，具体可为20mmol/L、60mmol/L；所述硝酸银溶液的浓度为1-10mmol/L，具体可为6mmol/L、10mmol/L；所述抗坏血酸溶液的浓度为50-100mmol/L，具体可为70mmol/L、80mmol/L；所述适配体DNA溶液的浓度为0.1-10μmol/L，具体可为2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L；所述染料溶液的浓度为0.1-10μmol/L，具体可为4μmol/L、8μmol/L；所述羟胺盐酸盐溶液的浓度为0.1-1mol/L，具体可为0.4mol/L；所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种UV和SERS同时检测食源性致病菌的方法，包括下述步骤：/nS1、将十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液混合后进行第一反应，得到第一混合液；/nS2、将步骤S1得到的所述第一混合液与十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液混合后进行第二反应，收集固体产物；将所述固体产物与水混合，得到第二混合液；/nS3、将步骤S2得到的所述第二混合液与适配体DNA溶液、染料溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯铂酸溶液混合后进行第三反应，得到用于检测食源性致病菌的SERS信号探针和纳米酶溶液；/nS4、将含有纳米磁球的液体与食源性致病菌的抗体溶液混合，得到捕获探针溶液；/nS5、将步骤S3得到的所述用于检测食源性致病菌的SERS信号探针和纳米酶溶液、步骤S4得到的捕获探针溶液和待检测溶液混合后进行测试反应，磁分离后得到食源性致病菌检测混合液；/nS6、将步骤S5得到的所述食源性致病菌检测混合液进行SERS检测；/nS7、将步骤S5得到的所述食源性致病菌检测混合液与3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液、H

【技术特征摘要】
1.一种UV和SERS同时检测食源性致病菌的方法，包括下述步骤：
S1、将十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液混合后进行第一反应，得到第一混合液；
S2、将步骤S1得到的所述第一混合液与十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液混合后进行第二反应，收集固体产物；将所述固体产物与水混合，得到第二混合液；
S3、将步骤S2得到的所述第二混合液与适配体DNA溶液、染料溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯铂酸溶液混合后进行第三反应，得到用于检测食源性致病菌的SERS信号探针和纳米酶溶液；
S4、将含有纳米磁球的液体与食源性致病菌的抗体溶液混合，得到捕获探针溶液；
S5、将步骤S3得到的所述用于检测食源性致病菌的SERS信号探针和纳米酶溶液、步骤S4得到的捕获探针溶液和待检测溶液混合后进行测试反应，磁分离后得到食源性致病菌检测混合液；
S6、将步骤S5得到的所述食源性致病菌检测混合液进行SERS检测；
S7、将步骤S5得到的所述食源性致病菌检测混合液与3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液、H2O2溶液和缓冲液混合，进行UV检测。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤S1中，所述第一混合液中，十六烷基三甲溴化铵、氯金酸和硼氢化钠的摩尔比依次为1000：(2-5)：(2-10)；
所述第一反应的反应条件为：温度为25-27℃，时间为0.5-3h；
所述步骤S2中，所述十六烷基三甲溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液、第一混合液体和抗坏血酸溶液的体积比为1000：(1-20)：(0.1-2.5)：(2-10)：(1-10)；
所述第二反应的反应条件为：温度为25-35℃，时间为0.5-3h；
所述固体产物和水的质量比为1：(20-1000)。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述适配体DNA序列由调控生长的序列和识别菌的序列组成，其中调控生长的序列由10-30个A、T或A和T的混合序列组成，识别菌的序列根据所要检测的食源性致病菌的种类进行选取；
具体的，所述适配体DNA溶液中的DNA序列为如下1)-3)中任一种：
1)序列表中序列1：
5′-AAAAAAAAAAAAAAAATCCGTCACACCTGCTCTGTCTGCGAGCGGGGCGCGGGCCCGGCGGGGGATGGTGGTGTTGCTCCCGTAT-3′
2)序列表中序列2：5′-AAAAAAAAAAAAAAAGCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3′
3)序列表中序列3：
5′-AAAAAAAAAAAAAAATATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3′；
所述第二混合液、适配体DNA溶液、染料溶液、羟胺盐酸盐溶液和氯铂酸溶液的体积比为100：(1-8)：(0.05-1)：(0.1-1.5)：(1-10)；
所述第三反应的条件为：温度为25-27℃，时间为1-4h；
所述步骤S4中，所述抗体为生物素标记的抗体；所述纳米磁球为链霉亲和素标记的纳米磁球；所述抗体和纳米磁球通过生物素-链霉亲和素结合；
所述含有纳米磁球的液体和食源性致病菌的抗体溶液的体积比为100：(2-5)；
所述含有纳米磁球的液体中的纳米磁球为磁珠、纳米Fe3O4和/或纳米Fe2O3；所述纳米磁球的粒径为100-500nm。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：
所述步骤S5中，所述待检测溶液、用于检测食源性致病菌的信号探针和纳米酶溶液和捕获探针溶液的体积比为1：(10-200)：(10-200)；
所述测试反应条件为：温度为25-30℃，时间为0.25-2h；
所述步骤S7中，所述测试混合液、TMB溶液、H2O2溶液和缓冲液的体积比为1：(2-5)：(2-10)：40。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述十六烷基三甲溴化铵溶液的浓度为0.02-1mol/L；所述氯金酸溶液的浓度为0.1-10mol/L，；所述硼氢化钠溶液的浓度为1-100mmol/L；所述硝酸银溶液的浓度为1-10mmol/L；所述抗坏血酸溶液的浓度为50-100mmol/L；所述适配体DNA溶液的浓度为0.1-10μmol/L；所述染料溶液的浓度为0.1-10μmol/L；所述羟胺盐酸盐溶液的浓度为0.1-1mol/L；所述氯铂酸溶液的浓度为30-300mmol/L；所述含有纳米磁球的液体中纳米磁球的浓度为50-500μg/mL；所述抗体溶液的浓度为2-10mg/mL；所述TMB溶液的浓度为100-500mmol/L；所述H2O2溶液的浓度为0.5-2mol/L；所述缓冲液溶液的浓度为0.1-1mol/L；
所述食源性致病菌包括大肠杆菌、副溶血弧菌和沙门氏菌中的至少一种；
所述染料物质为具有特征拉曼信号峰且可溶于水的染料物质，具体包括罗丹明，亚甲基蓝；
所述缓冲液为酸性缓冲液，包括柠檬酸钠缓冲液、醋酸钠溶液、醋酸钾溶液或磷酸钾溶液。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：将步骤S5得到的所述食源性致病菌检测混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑金铠，陆畅，周帅帅，李玉芝，高飞，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11