一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法技术

本发明专利技术涉及一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法及其应用，包括：肽酶的固定化；利用固定化酶反应器酶解多肽。首先将氨肽酶和羧肽酶分别制成固定化酶反应器，再利用固定化酶反应器从多肽的C端或者N端进行酶解，从而得到氨基酸序列连续的多肽酶解产物。本发明专利技术优点是：使用固定化酶反应器酶解效率高；使用该方法可获得酶解后氨基酸序列连续的产物；方法所制得的固定化酶反应器易于保存，可重复使用。

An enzymatic method for sequencing based on immobilized peptidase reactor

【技术实现步骤摘要】
一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法
本专利技术涉及多肽的水解酶水解方法，即一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法，以实现获得连续的肽酶酶解产物。
技术介绍
对蛋白质的氨基酸序列的测定是蛋白质组学领域中的重要技术之一，蛋白质以及多肽测序的传统方式主要是对DNA的序列分析和Edman降解测序。Edman降解是化学法对多肽进行末端水解，通过使多肽N末端与异硫氰酸苯酯反应，在酸性环境中可使N末端氨基酸脱落，从而达到逐个水解氨基酸的目的，通过液相色谱法检测氨基酸种类，从而得到肽段N段的若干氨基酸序列。但此方法只能从多肽N端水解并且无法水解N末端被封闭的的多肽。除了化学法肽酶酶解法也可对多肽进行末端水解，是通过利用羧肽酶或氨肽酶与多肽反应，使多肽C末端或N末端的氨基酸残基水解，通过质谱检测酶解前后多肽的分离量差异，从而确定氨基酸种类，最终确定多肽C端和N段的氨基酸序列。但在自由溶液中进行肽酶水解，无法控制多肽的水解程度，水解产物氨基酸序列不具有连续性。为克服以上方法存在的问题，我们选择利用肽酶固定化酶反应器对多肽进行酶解，通过控制流速来改变多肽的酶解程度，以实现高效酶解并获得氨基酸序列连续的酶解产物。
技术实现思路
本专利技术发展了一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法，酶解效率高，可获得连续的酶解产物，可重复使用。为了实现该目的，本专利技术的技术方案是：一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法，包括：利用固定化羧肽酶反应器和固定化氨肽酶反应器酶解多肽。所述的酶解方法，1)将肽酶固定在石英毛细管柱中；2)使用固定化羧肽酶和氨肽酶对多肽进行酶解。所述的方法，1)将肽酶固定在石英毛细管柱中，其具体步骤如下：将羧肽酶溶在pH3-10的缓冲液中，羧肽酶终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液A，在温度为4℃-10℃时向毛细管柱中通入溶液A，流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，再用1-3mL水以流速10μL/min冲洗100min，得到羧肽酶固定化酶反应器；将氨肽酶溶在pH3-10的缓冲液中，氨肽酶终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液A，在温度为4℃-10℃时向毛细管柱中通入溶液A，流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，再用1-3mL水以流速10μL/min冲洗100min，得到氨肽酶固定化酶反应器；2)使用固定化酶反应器对多肽进行酶解，其具体步骤如下：将多肽溶解在pH3-10的缓冲液中，多肽终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液B，将溶液B在离心并取其上清得到溶液C；将溶液C先后分别通入羧肽酶固定化酶反应器和氨肽酶固定化酶反应器；流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，反应温度为20-90℃。将溶液C先通入羧肽酶固定化酶反应器、后通入氨肽酶固定化酶反应器；或将溶液C先通入氨肽酶固定化酶反应器、后通入羧肽酶固定化酶反应器。羧肽酶包括但不限于羧肽酶Y、羧肽酶A和羧肽酶B中的一种或两种。所述的石英毛细管柱包括但不限于开管柱、整体柱和填充柱中的一种或两种以上。所述的方法，其可应用于生物样品中蛋白水解酶水解底物或多肽，水解底物或多肽再酶解后序列的测定，生物样品为细胞、组织、体液中的一种或二种以上；所述多肽为生物样品中蛋白水解酶水解底物或多肽。所述的方法,可用于对药物多肽或生物毒液中多肽酶解后的氨基酸序列测定。进一步地，1)将肽酶固定在石英毛细管柱中将羧肽酶或氨肽酶溶在pH3-10的缓冲液中，肽酶终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液A，在温度为4℃-10℃时向含有吸附性填料的毛细管柱中通入溶液A，流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，再用1mL水以流速10μL/min冲洗100min，将多余的羧肽酶或氨肽酶冲洗干净，得到羧肽酶固定化酶反应器。2)使用羧肽酶固定化酶反应器对多肽进行酶解将多肽溶解在pH3-10的缓冲液中，多肽终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液B，将溶液B在离心并取其上清得到溶液C，将溶液C通入羧肽酶固定化酶反应器，流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，反应温度为20-50℃，收集经过固定化酶反应器的肽段。3)使用氨肽酶固定化酶反应器对多肽进行酶解将多肽溶解在pH3-10并含有5mM-50mM的氯化钴缓冲液中，多肽终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液D，将溶液D在离心并取其上清得到溶液E，将溶液E通入氨肽酶固定化酶反应器，流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，反应温度为50-90℃，收集经过固定化酶反应器的肽段。本专利技术具有如下优点：1、使用固定化酶反应器酶解效率高；2、使用该方法可获得酶解后氨基酸序列连续的产物；3、方法所制得的固定化酶反应器易于保存，可重复使用。附图说明图1用羧肽酶固定化酶反应器酶解氨基酸序列为FPRPGGGGNGDFEEIPEEYL多肽药物比伐卢定结果图；图2用羧肽酶固定化酶反应器酶解氨基酸序列为RVYVHPF多肽结果图；图3用氨肽酶固定化酶反应器酶解氨基酸序列为SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYP多肽药物促肾上腺皮质激素结果图；图4用氨肽酶固定化酶反应器酶解氨基酸序列为RVYVHPF多肽结果图。具体实施方式实施例1以利用羧肽酶固定化酶反应器酶切氨基酸序列为FPRPGGGGNGDFEEIPEEYL多肽药物比伐卢定为例。将羧肽酶溶解在pH7.0的缓冲液中，肽酶终浓度为0.01mg/mL，得到溶液A，在温度为4℃时向毛细管柱中通入溶液A，流速为0.05μL/min，通入时间为6h，再用1mL水以流速10μL/min冲洗100min，得到羧肽酶固定化酶反应器。将序列为FPRPGGGGNGDFEEIPEEYL多肽药物比伐卢定为溶解在pH7.0的缓冲液中，多肽终浓度为0.1mg/mL，得到溶液B，将溶液B在离心并取其上清得到溶液C，将溶液C通入固定化酶反应器，流速为2μL/min通入10min，流速为1μL/min通入20min；流速为0.5μL/min通入40min；流速为0.25μL/min通入80min；流速为0.125μL/min通入160min；流速为0.062μL/min通入320min；流速为0.031μL/min通入640min，反应温度为25℃，收集经过固定化酶反应器的肽段。通过质谱分析证明可获得氨基酸序列连续的酶解结果。实施例2以利用羧肽酶固定化酶反应器酶切氨基酸序列为RVYVHPF多肽为例。将羧肽酶溶解在pH7.0的缓冲液中，肽酶终浓度为0.01mg/mL，得到溶液A，在温度为4℃时向毛细管柱中通入溶液A，流速为0.05μL/min，通入时间为6h，再用1mL水以流速10μL/min冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法，其特征在于：包括利用固定化羧肽酶反应器和固定化氨肽酶反应器酶解多肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法，其特征在于：包括利用固定化羧肽酶反应器和固定化氨肽酶反应器酶解多肽。


2.按照权利要求1所述的酶解方法，其特征在于：
1)将肽酶固定在石英毛细管柱中；
2)使用固定化羧肽酶和氨肽酶对多肽进行酶解。


3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：
1)将肽酶固定在石英毛细管柱中，其具体步骤如下：
将羧肽酶溶在pH3-10的缓冲液中，羧肽酶终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液A，在温度为4℃-10℃时向毛细管柱中通入溶液A，流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，再用1-3mL水以流速10μL/min冲洗100min，得到羧肽酶固定化酶反应器；
将氨肽酶溶在pH3-10的缓冲液中，氨肽酶终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液A，在温度为4℃-10℃时向毛细管柱中通入溶液A，流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，再用1-3mL水以流速10μL/min冲洗100min，得到氨肽酶固定化酶反应器；
2)使用固定化酶反应器对多肽进行酶解，其具体步骤如下：
将多肽溶解在pH3-10的缓冲液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，杨超，单亦初，杨开广，吴琼，张玉奎，梁振，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21