一种胚乳原生质体瞬时表达外源基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种胚乳原生质体瞬时表达外源基因的方法。包括以下步骤：(1)将处于灌浆前期的禾本科作物籽粒切块并酶解4～8h；(2)然后加入酶解终止液并过滤，收集滤液，离心得到原生质体；(3)重悬原生质体，冰浴20～40min后，离心去上清，然后再继续进行重悬纯化；(4)将经步骤(3)纯化的原生质体与质粒混合，然后加入PEG‑Ca

A method of transient expression of foreign genes in endosperm protoplasts

【技术实现步骤摘要】
一种胚乳原生质体瞬时表达外源基因的方法
本专利技术属于细胞工程
，具体涉及一种禾本科胚乳原生质体瞬时表达外源基因的方法。
技术介绍
原生质体是去除细胞壁的植物或真菌细胞，包括细胞膜、细胞质和细胞核等完整的细胞器。由于具有完整的细胞器，并且没有细胞壁的屏蔽，原生质体更容易吸收和整合外源核酸和蛋白质，使得原生质体成为一种快捷便利的基因功能分析系统。基于原生质体瞬时表达系统已广泛应用于植物分子生物学和细胞生物学研究，在蛋白质亚细胞定位、蛋白质之间的相互作用、细胞信号通路传导、细胞环境应激和转录调控网络分析等方面发挥了巨大的作用。原生质体的分离技术在多种植物多种组织中已有广泛报道，但是原生质体的瞬时表达系统目前报道的主要集中在模式植物拟南芥、烟草和禾本科植物如水稻、玉米、小麦的幼嫩叶肉细胞中，叶肉细胞原生质体体统的建立在基因功能研究上发挥了巨大作用，但对于多数功能基因来说，表达和功能发挥多具有细胞或组织特异性，成熟的叶肉细胞原生质体瞬时表达系统不能够完全满足功能分析的需要，因此，发展特定关键细胞的原生质体瞬时转化系统对推动基因功能研究尤为重要。胚乳是禾本科作物的主要贮藏器官，作物的营养成分主要贮藏在胚乳中，因此胚乳细胞发育和细胞内贮藏物质的积累对作物产量以及品质具有重要影响。从生物功能上讲，胚乳可以为早期胚的发育提供营养和保护，双子叶植物拟南芥胚乳在胚的发育过程中就被耗尽，因此成熟拟南芥种子中并不存在胚乳；相反，在禾本科作物如玉米中，胚乳是成熟种子的主要组成部分，禾本科作物的胚乳有助于种子在恶劣条件下存活，并在萌发过程中为幼苗生长提供初级营养物质和激素，因此，胚乳对禾本科种子的生长发育起着至关重要的整合作用。胚乳的发育起源于植物的双受精过程，授粉后1-3天，双受精形成的三倍体初生胚乳核不断分裂形成合胞体，但不分裂形成细胞壁，合胞体中多个细胞核存在于一个大的胚乳细胞内，细胞的中央部分为大液泡，初生胚乳核被大液泡挤压至胚乳细胞的靠近细胞膜的边缘；授粉后约3-4天，细胞内每个细胞核周围开始形成细胞壁，一个大的合胞体便形成了多细胞胚乳，此时胚乳细胞均围绕在胚乳的外表面，胚乳内部是中空的；此后，胚乳细胞进入有丝分裂阶段向胚乳内增殖，逐渐填充胚乳的中空部分，咋有丝分裂阶段，不同部位的胚乳细胞要进行分化，特化为传递细胞、糊粉层细胞、中央淀粉质胚乳细胞和胚胎周围细胞。传递细胞的功能是将营养物质从母体组织中转运到胚乳细胞，供应前期胚乳细胞发育和中后期贮藏物质积累所需的原料和能量；而淀粉质胚乳和糊粉层则富含淀粉颗粒、贮藏蛋白质和矿物质，是谷物贮藏物质的主要积累部位；胚胎周围细胞可能参与胚乳和胚胎之间营养交流和转移。在有丝分裂完成后，胚乳细胞进入核内复制期，细胞内染色体经过多轮复制而细胞不分裂，形成多倍体胚乳，次过程持续到胚乳灌浆中后期，最后胚乳进入成熟并经历细胞程序化死亡，形成成熟种子的胚乳部分。由于胚乳在禾本科种子发育和作物生产过程中的重要作用，与胚乳发育以及贮藏物质合成和积累相关基因的功能解析一直是研究热点，但当前对于胚乳发育和贮藏物质积累过程和调控的认识还远远不够。目前还没有关于禾本科作物胚乳原生质体瞬时转化系统的报道，部分原因是胚乳中含有高度分化的细胞影响了原生质体制备量、活性和外源基因的转化效率。研究表明，高度分化的胚乳细胞内的淀粉颗粒降低了原生质体产量和完整性。然而，如果挑选合适时期的胚乳，仔细筛选原生质体分离和转化的最优条件，是可以建立高效可靠的原生质体瞬时表达系统的。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种胚乳原生质体瞬时表达外源基因的方法，建立了一种玉米胚乳原生质体高效分离和转化系统，该系统可用于禾本科胚乳原生质体中进行各种分子生物学操作。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种胚乳原生质体瞬时表达外源基因的方法，包括以下步骤：(1)将处于灌浆前期的禾本科作物籽粒切块并于20～30℃黑暗环境中酶解4～8h；(2)然后加入酶解终止液并过滤，收集滤液，离心得到原生质体；(3)重悬原生质体，冰浴20～40min后，离心去上清，然后再继续进行重悬纯化；(4)将经步骤(3)纯化的原生质体与质粒混合，然后加入PEG-Ca2+溶液，于室温黑暗环境中静置转化15～30min；质粒、原生质体与PEG-Ca2+溶液的体积比为0.5～1:5～10:11～15；(5)再继续加入W5溶液，混匀后离心，去上清，然后重悬并在20～30℃，黑暗环境中培养6～18h后，离心去上清，再次进行重悬即可。进一步地，灌浆前期的禾本科作物籽粒为授粉6～10天后的籽粒。进一步地，籽粒为玉米籽粒。进一步地，酶解使用的酶解液包括1-2％CellulaseR10、0.5-1％MacerozymeR10、0.1-0.3MMES、0.4-0.8Mmannitol、0.05-0.2％BSA，以及0.5M-1.5MCaCl2。进一步地，酶解温度为23～27℃。进一步地，酶解终止液为W5溶液。进一步地，过滤用的滤膜为尼龙膜，其孔径为50～100μm。进一步地，步骤(3)和步骤(5)中初次重悬时使用的溶液为均W5溶液，再次重悬时使用的溶液均为MMG溶液。进一步地，质粒、原生质体与PEG-Ca2+溶液的体积比为1:10:11。进一步地，PEG-Ca2+溶液包括0.8Mmannitol、1MCaCl2，以及质量分数为30％的PEG4000。进一步地，转化温度为26℃，转化时间为20min。进一步地，步骤(2)、步骤(3)和步骤(5)离心过程为：于110～130r/min离心1～3min即可。本专利技术的有益效果为：本专利技术为大量实验优化后获得的最佳条件组合，制备得到的胚乳原生质体数量多、活性高，原生质体转化效率高；其中，原生质体平均产量为8.03×106个·mL-1，活性可达95％以上，最高瞬时转化效率可高于68％。能够为胚乳性状相关基因功能分析、胚乳细胞信号传导以及胚乳生物反应器等相关研究提供有力的技术支持。附图说明图1为授粉后8天的新鲜玉米雌穗；图2为授粉后不同天数的玉米胚乳；其中，从左至右依次为授粉后10、9、8、7、6天的玉米胚乳；图3为玉米籽粒、珠心与胚乳图片；图4为玉米胚乳取材及酶解处理；其中，A为授粉后8天的新鲜玉米雌穗，B为挑取玉米胚乳于低渗MS固体培养基上，C为玉米胚乳原生质体在26℃黑暗条件下静置酶解6h；图5为FDA对玉米胚乳原生质体染色进行活力检测；其中，A为白光下的原生质体，B为绿光下的原生质体，C为组合的原生质体。(注：图片在荧光显微镜下10×10观测)；图6为玉米胚乳原生质体转化图片；其中，A为白光下的原生质体，B为GFP荧光通道下的原生质体，C为组合的原生质体。(注：图片在荧光显微镜下10×10观测)；图7为转化后原生质体提取总蛋白的免疫印迹图片；其中，条带M为Maker；pBI221-GFP为实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胚乳原生质体瞬时表达外源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将处于灌浆前期的禾本科作物籽粒切块并于20～30℃黑暗环境中酶解4～8h；/n(2)然后加入酶解终止液并过滤3～5次，收集滤液，离心得到原生质体；/n(3)重悬原生质体，冰浴20～40min后，离心去上清，然后再继续进行重悬纯化；/n(4)将经步骤(3)纯化的原生质体与质粒混合，然后加入PEG-Ca

【技术特征摘要】
1.一种胚乳原生质体瞬时表达外源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将处于灌浆前期的禾本科作物籽粒切块并于20～30℃黑暗环境中酶解4～8h；
(2)然后加入酶解终止液并过滤3～5次，收集滤液，离心得到原生质体；
(3)重悬原生质体，冰浴20～40min后，离心去上清，然后再继续进行重悬纯化；
(4)将经步骤(3)纯化的原生质体与质粒混合，然后加入PEG-Ca2+溶液，于20～30℃，黑暗环境中静置转化15～30min；所述质粒、原生质体与PEG-Ca2+溶液的体积比为0.5～1:5～10:11～15；
(5)再继续加入W5溶液，混匀后离心，去上清，然后重悬并在20～30℃，黑暗环境中培养6～18h后，离心去上清，再次进行重悬即可。


2.根据权利1所述的胚乳原生质体瞬时表达外源基因的方法，其特征在于，所述灌浆前期的禾本科作物籽粒为授粉后6～10天的籽粒。


3.根据权利1所述的胚乳原生质体瞬时表达外源基因的方法，其特征在于，所述酶解使用的酶解液包括1-2％CellulaseR10、0.5-1％MacerozymeR10、0.1-0.3MMES、0.4-0.8Mmannitol、0.05-0.2％BSA，以及0.5M-...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄玉碧，胡育峰，高蕾，李炀平，宋大林，黄焕焕，张军杰，刘汉梅，余国武，刘应红，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51