OsSWEET13基因突变体及其在提高水稻产量中的应用制造技术

本发明专利技术提供了OsSWEET13突变体，并公开了一种提高水稻产量的方法包括通过CRISPR/Cas9技术编辑OsSWEET13基因，在OsSWEET13基因的第一外显子和第二外显子的第一靶点和第二靶点之间有240个碱基缺失，在第三个靶点插入一个碱基；或者在第一个靶点和第二个靶点之间有238个碱基的片段被反向，在第三个靶点上有一个碱基插入。本发明专利技术通过编辑编辑OsSWEET13基因，获得提高水稻产量的水稻植株，并具有耗时短且不会影响水稻其他品质的优点。

Ossweet13 gene mutant and its application in increasing rice yield

【技术实现步骤摘要】
OsSWEET13基因突变体及其在提高水稻产量中的应用
本专利技术涉及生物
，更具体地，本专利技术涉及OsSWEET13基因突变体及其在提高水稻产量中的应用。
技术介绍
现阶段水稻品种主要还是通过传统育种和分子育种相结合的方法来进行培育，希望通过水稻育种获得既优质又高产的水稻品种。这种方法通常是将高产水稻品种和优质水稻品种进行杂交，随后通过和优质水稻品种回交，筛选既高产又优质的水稻株系，至少需要六代才能获得稳定遗传的高产优质水稻品种。传统育种和分子育种主要具有以下缺点：1、耗时长：至少需要7代的杂交、回交或者自交才能获得稳定遗传的高产优质水稻品种，一年种两季水稻，那么最短也需要3年半的时间。2、稻米品质可能受到影响：稻米品质这一指标无法用肉眼进行筛选，如果没有合适的检测机器，那么有可能在经过几代的筛选之后，最后的稳定遗传水稻株系的稻米品质有所下降。3、筛选难：稻米品质是否优质很难通过观察进行判断；稻米品质由多基因位点控制，很难通过简单的分子检测准确地判断出稻米品质是否优质；如果每一代都利用检测仪器对稻米品质进行检测筛选，那么费用会很高。因此有可能在经过几代的筛选之后，最后的稳定遗传水稻株系的稻米品质有所下降。OsSWEET13基因之前报道为水稻白叶枯病的感病基因，将其启动子编辑之后可对部分白叶枯病菌产生抗性。但是没有该基因和水稻产量等相关农艺性状关系的报道。此外，之前对OsSWEET13基因的编辑应用都集中在白叶枯抗性方面。OsSWEET13基因启动子被编辑之后，OsSWEET13无法被病原菌激活，可以产生白叶枯抗性，但是OsSWEET13基因在生长发育中仍然能够正常表达，所以可能无法产生增产的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种提高水稻产量的方法，该方法通过编辑OsSWEET13基因，可以稳定有效地提高水稻的产量。实现上述目的的技术方案如下。一种提高水稻产量的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术编辑OsSWEET13基因，在OsSWEET13基因的第一外显子和第二外显子的第一靶点和第二靶点之间有240个碱基缺失，在第三个靶点插入一个碱基A；或者在第一个靶点和第二个靶点之间有238个碱基片段被反向，在第三个靶点上有一个碱基A插入。在其中一些实施例中，所述第一个靶点：5’-GAGAGGAATGAAGGGAGTTG-3’位于chr12:17305328..17305347所述第二个靶点：5’-AGGCCGAAGGCAAAAGCCCA-3’位于chr12:17305088..17305107所述第三个靶点：5’-GATAGGTCGTGAAGGATATG-3’位于chr12:17304108..17304127。在其中一些实施例中，所述方法包括以下步骤：(1)第一轮PCR：(i)以pYLgRNA-OsU3/LacZ质粒为模板，进行PCR反应，(ii)以pYLgRNA-OsU6b质粒为模板,进行PCR反应，(iii)以pYLgRNA-OsU6a质粒为模板,进行PCR反应；(2)第二轮PCR：对(i)(ii)和(iii)得到的PCR反应的产物为模板，分别进行PCR反应，分别得到第二轮的PCR产物；(3)得到的第二轮的PCR产物进行双元载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应，得到连接产物；(4)连接产物转化(热激发)：将连接产物电激转化感受态细胞，电激后培养；(5)提取质粒，MluI或AscI酶切电泳检测sgRNA表达盒连接片段；(6)导入农杆菌，获得的克隆转化农杆菌；(7)获得的阳性农杆菌可用于侵染植物组织；(8)获得OsSWEET13转基因T0植株；(9)经过一代自交繁种，T1代获得产量提高的水稻植株。在其中一些实施例中，步骤(1)中第一轮PCR的引物序列依次为：SEQIDNO.10和SEQIDNO.5、SEQIDNO.10和SEQIDNO.7、和SEQIDNO.10和SEQIDNO.9。在其中一些实施例中，步骤(1)中第一轮PCR的引物序列依次为：SEQIDNO.11和SEQIDNO.4、SEQIDNO.11和SEQIDNO.6、和SEQIDNO.11和SEQIDNO.8。在其中一些实施例中，步骤(2)中第一轮PCR的引物序列分别为：SEQIDNO.12和SEQIDNO.13、SEQIDNO.14和SEQIDNO.15、和SEQIDNO.16和SEQIDNO.17。在其中一个实施例中，所述农杆菌为EHA105。本专利技术的另一目的是提供OsSWEET13基因突变体。OsSWEET13基因突变体CR-S13-1，其基因序列如SEQIDNO.2所示。OsSWEET13基因突变体CR-S13-2，其基因序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的另一目的是提供上述OsSWEET13基因突变体在提高水稻产量的方法或者生物制剂中应用。本专利技术利用CRISPR/Cas9技术直接编辑水稻品种中花11(ZH11)中的OsSWEET13基因。在OsSWEET13的启动子，第一外显子和第二外显子各选定一个靶点。被编辑后的OsSWEET13突变体CR-S13-1在第一靶点和第二靶点之间有240个碱基缺失，在第三个靶点有一个碱基A插入。另一个编辑后的OsSWEET13突变体CR-S13-2在第一个靶点和第二个靶点之间有238个碱基的片段被反向，在第三个靶点上有一个碱基A插入。本专利技术的所述提高水稻产量的方法，具有以下优点：1、同时提高水稻抗性和产量。OsSWEET13是一个水稻白叶枯感病基因，其缺失或者启动子的突变之前已经被证实可以对小部分水稻白叶枯病菌小种产生抗性。我们通过找到合适的靶点，用CRISPR/Cas9技术编辑(敲除)OsSWEET13基因之后发现水稻在正常生长条件下产量有了显著的提高。说明我们在本专利技术中获得的两个OsSWEET13突变体CR-S13-1和CR-S13-2同时提高了水稻抗性和产量。在选择OsSWEET13的靶点时，我们在启动子区域，第一外显子和第二外显子分别选取一个靶点，达到了能够彻底破坏OsSWEET13这个基因的功能。将启动和编码区域都破坏之后其还能再编码有功能的OSWEET13蛋白的可能性大大降低。实际上从最后结果来看，我们获得的两个突变体都彻底破坏了OsSWEET13的编码区域，为两个OsSWEET13敲除突变体。2、耗时短。理论上来说水稻品种中的一个基因被CRISPR/Cas9编辑破坏其基因功能之后，只需要两代(一年)就能拿到编辑纯合并且无筛选标记的水稻株系，和传统育种三年半的耗时相比大大缩短了品种培育所需要的时间。3、不引入影响稻米品质的基因。CRISPR/Cas9特异地编辑OsSWEET13，理论上并不影响基因组里面的其它基因，因此理论上不会影响水稻的稻米品种。附图说明图1.野生型OsSWEET13和被编辑的CR-S13本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高水稻产量的方法，其特征是，包括通过CRISPR/Cas9技术编辑OsSWEET13基因，在OsSWEET13基因的第一外显子和第二外显子的第一靶点和第二靶点之间有240个碱基缺失，在第三个靶点插入一个A碱基；或者在第一个靶点和第二个靶点之间有238个碱基片段被反向，在第三个靶点上有一个A碱基插入。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高水稻产量的方法，其特征是，包括通过CRISPR/Cas9技术编辑OsSWEET13基因，在OsSWEET13基因的第一外显子和第二外显子的第一靶点和第二靶点之间有240个碱基缺失，在第三个靶点插入一个A碱基；或者在第一个靶点和第二个靶点之间有238个碱基片段被反向，在第三个靶点上有一个A碱基插入。


2.根据权利要求1所述的提高水稻产量的方法，其特征是，所述第一个靶点：5’-GAGAGGAATGAAGGGAGTTG-3’，位于chr12:17305328..17305347；
第二个靶点：5’-AGGCCGAAGGCAAAAGCCCA-3’，位于chr12:17305088..17305107；
第三个靶点：5’-GATAGGTCGTGAAGGATATG-3’，位于chr12:17304108..17304127。


3.根据权利要求1所述的提高水稻产量的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：(1)第一轮PCR：(i)以pYLgRNA-OsU3/LacZ质粒为模板，进行PCR反应，(ii)以pYLgRNA-OsU6b质粒为模板,进行PCR反应，(iii)以pYLgRNA-OsU6a质粒为模板,进行PCR反应；
(2)第二轮PCR：对(i)(ii)和(iii)得到的PCR反应的产物为模板，分别进行PCR反应，分别得到第二轮的PCR产物；
(3)得到的第二轮的PCR产物进行双元载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应，得到连接产物；
(4)连接产物转化：将连接产物电激转化感受态细胞，电激后培养；
(5)提取质粒，MluI或AscI酶切电泳检测sgRNA表达盒连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明永，曾璇，夏快飞，罗宇芬，吴佳，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44