本发明专利技术涉及甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6序列的鉴定及应用，涉及一个既能提高油菜产量又能提高油菜种子含油量的叶绿体脂肪酸转运蛋白基因。BnFAX6基因包含3个外显子和2个内含子，编码一个含有119个氨基酸的蛋白质。BnFAX6基因在油菜油脂合成关键时期的种子中优势表达。与野生型相比，过量表达BnFAX6转基因油菜种子含油量显著提高，这表明BnFAX6在油菜种子油脂合成过程中起重要作用。35S启动子驱动的BnFAX6过量表达转基因油菜与野生型相比还表现出植株高度变矮，侧枝增多，产量大幅度提高的表型。综上所述，本发明专利技术提供了一个在油菜高产高含油量育种中具有重要应用价值的功能基因。
【技术实现步骤摘要】
甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6的鉴定及应用
：本专利技术涉及一个既能提高油菜产量又能提高种子含油量的脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6的克隆与功能鉴定。
技术介绍
：油菜是我国四大油料作物之一。菜籽油不仅是食用油的主要来源，还是解决全球能源短缺的重要原料作物。随着世界人口的递增，人们对食用油和生物柴油的需求量日益剧增。菜籽油是我国食用植物油的第一大来源，虽然我国油菜种植面积和总产量均占世界的30％左右，但由于人口众多，每年的油菜籽进口量依然巨大。因此，提高油菜产量和种子含油量一直是油菜产业发展的研究方向和育种目标。植物的分枝数是影响其植株结构和产量的重要因子。植物在生长过程中，其顶芽往往优先生长，而侧芽常受到抑制，我们称之为“顶端优势”。目前关于顶端优势现象产生的原因，还没有肯定意见，其主要包括“生长素抑制学说”，“营养学说”和“营养调运”三大观点。生长素抑制学说指出，植物顶端优势是由于顶芽合成的生长素向下运输过程中抑制了侧芽的产生，随后进一步发现其可能是通过影响侧芽中细胞分裂素的浓度而造成的。营养学说认为，由于顶芽细胞生长迅速，代谢旺盛，因而优先享用由根部和叶片运来的营养物质，使侧芽得不到充足的养分，从而生长受到抑制。营养调运学说则认为顶端分生组织的细胞生长活跃，代谢旺盛，合成大量激素，促使营养物质向顶芽调运，使侧芽得不到足够的营养物质而受到抑制。总之，植物地上株型是个复制的生物学现象，受多种因素调控，而营养物质通过改变资源分配，深刻地影响着地上株型。当植物光照充足，碳源大量积累，往往会产生更多侧枝而使产量提高。脂质作为重要的能源物质和膜组成成分以及信号分子，与植物地上株型有着密切关联。提高油菜种子中油脂含量往往比提高其产量更有价值。油菜种子中油脂合成是一个复杂的生物学过程，涉及多个细胞器的酶促反应。糖酵解和丙酮酸代谢产物乙酰辅酶A在质体中合成脂肪酸，合成的脂肪酸需要转运出叶绿体，在细胞质中形成脂酰辅酶A，然后运输到内质网中，与甘油骨架一起合成三酰甘油，然后与油体蛋白共同组成油体。目前，在提高种子含油量的研究中，主要采取“推”和“拉”的手段。所谓的“推”是指增强碳源向脂肪酸的流动，从而提高含油量；而“拉”则是通过增加三酰甘油的组装速度，使得含油量增加。但是，处于叶绿体膜上控制脂肪酸流动的“阀门”却鲜有报道。植物中FAX蛋白属于Tmemb_14蛋白亚家族，具有典型的跨膜结构域。在哺乳动物中，与FAX同源的蛋白定位于线粒体膜上，其生物学功能未知。虽然在拟南芥中已有报道FAX1增加叶绿体中合成的脂肪酸向外运输的速率，从而增加种子中油脂的积累，但是该类蛋白在油菜种子中的功能，以及其对油菜株型的影响尚不清楚。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一个新的油脂合成相关的脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6，对该基因进行克隆鉴定和功能分析，进而应用该基因提高油菜产量和含油量，创造油菜优良品种。为获得油脂合成相关的脂肪酸转运蛋白基因，我们利用已报道的拟南芥脂肪酸转运基因AtFAX1(AT3G57280.1)和AtFAX6(AT3G20510.1)，通过生物信息学方法在甘蓝型油菜基因组数据库中鉴定了12个脂肪酸转运相关的基因。对这12个脂肪酸转运蛋白基因的表达谱进行分析，发现BnFAX6基因在种子中优势表达。随后，我们克隆了该基因全长DNA序列，如SEQIDNo.1所示，全长3297bp，包含5’-上游启动子区(1–2000bp)、3个外显子(2001–2199bp，2839–2926bp，3047–3119bp)、2个内含子(2200-2838bp,2927-3046bp)和3’-UTR区(3120–3297bp)。其编码区含有360个碱基，编码119个氨基酸，如SEQIDNo.2所示，分子量为12.54kD。BnFAX6蛋白含有四个跨膜结构域，一个脂肪酸结合位点。荧光定量RT-PCR分析结果显示，BnFAX6在油菜不同组织中都有表达，在油脂合成关键时期的种子中优势表达(图1)。对两个亲缘关系很近但含油量不同的甘蓝型油菜品种的种子不同发育时期BnFAX6表达进行了比较分析，发现该基因在高含油量品种中的表达量显著高于低含油量品种(图1)，推测BnFAX6可能在油菜种子油脂合成过程中发挥重要功能。为探究BnFAX6在油菜发育过程中的生物学功能，我们构建了35S启动子驱动的BnFAX6过量表达载体，转化甘蓝型油菜Westar品种，获得转基因油菜植株。对BnFAX6过量表达转基因油菜在DNA水平和转录水平进行了鉴定，得到多个稳定遗传的转基因油菜株系(图2)。BnFAX6过量表达转基因油菜植株高度较野生型显著降低，分蘖数显著增加，种子总产量显著上升(图2)。而且，BnFAX6过量表达转基因油菜种子含油量较野生型显著提高。上述结果表明，BnFAX6基因一方面影响油菜株型而提高产量，另一方面影响油菜种子油脂合成而提高含油量。对除去顶端优势后的油菜侧芽中BnFAX6及侧芽生长关键负调控因子BnBRC1的表达进行分析，结果表明，与处于休眠状态的侧芽相比，除去顶端优势解除休眠后的侧芽中，BnFAX6的表达量逐渐升高，而BnBRC1的表达量逐渐下降(图3)。而且，与野生型相比，BnFAX6过量表达转基因油菜侧芽中BnBRC1表达水平也显著下调(图3)。这说明BnFAX6参与油菜侧芽起始和生长过程的调控。我们分析了35S启动子驱动的BnFAX6过量表达转基因油菜侧芽中糖酵解、脂肪酸合成和三酰甘油组装三个过程中的关键酶基因的表达情况，结果表明，与野生型相比，蔗糖运输和分解相关基因BnSUC1、BnSUS1和BnSUS3，糖酵解相关基因BnHXK1、BnPGK和BnFPA以及脂肪酸合成相关基因BnACCA2、BnMCAT和BnKAS在BnFAX6过量表达转基因油菜开花后25天的种子中表达量均明显上调，而BnGPAT、BnDGAT和BnFAE等三酰甘油组装和脂肪酸修饰相关基因的表达量没有明显变化(图4)。上述实验结果表明，过量表达BnFAX6上调侧芽中蔗糖运输和分解相关基因以及脂肪酸合成相关基因的表达，而不影响后续脂肪酸修饰和三酰甘油组装相关酶基因的表达，从而提高油脂的积累，促进侧芽生长发育。为进一步鉴定BnFAX6油菜种子油脂合成过程中的功能，我们构建了油菜种子特异性表达的BnNapinA启动子驱动的BnFAX6过量表达载体，转化甘蓝型油菜Westar品种，获得BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜植株。在DNA水平和转录水平对转基因植株进行了鉴定，得到多个稳定遗传的转基因油菜株系(图5)。对BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜成熟种子含油量进行分析发现，BnNapinApro:BnFAX6过量表达转基因油菜种子含油量较野生型显著提高(图5)。而且，与野生型相比，转基因油菜种子油脂中豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)和油酸(18:1)等低饱和度脂肪酸所占比例提高，而棕榈油酸(16:1)和(18:3)等所占比例下降(图5)。分析了BnNap本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6，其特征在于，DNA全长序列如SEQ ID No.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6，其特征在于，DNA全长序列如SEQIDNo.1所示。
2.甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白基因BnFAX6的cDNA序...
【专利技术属性】
技术研发人员：李学宝，黄克林，田婧，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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