本发明专利技术涉及一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用，属于食品工程领域、生物工程和微生物工程领域。本发明专利技术使用食品安全级的枯草杆菌B.subtilis800为宿主，在果胶酸内切水解酶基因(npg)的上下游分别融合编码特定多肽(SSSSHHHHHHHHSSS和SSHHHHSS)的核苷酸序列，并整合至枯草芽孢杆菌表达载体pBSCWZ，构建高效表达果胶酸内切水解酶的表达质粒(npg/pBSCWZ)和工程菌(npg/pBSCWZ/B.subtilis 800)，工程菌(npg/pBSCWZ/B.subtilis 800)表达食品级果胶酸内切水解酶的活性可达350U/mL。
【技术实现步骤摘要】
一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用
本专利技术涉及一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用，属于食品工程领域、生物工程和微生物工程领域。
技术介绍
果胶酸内切水解酶在食品工业、生物能源工业和植物活性物质药物成分提取过程中，具有降解果胶酸、促进植物多糖和纤维素糖化、促进植物细胞壁降解提高活性物质释放等多种应用。目前果胶酸内切水解酶的工业生产工艺，主要采取丝状真菌固态发酵生产，常用的真菌有黑曲霉、米曲霉和木霉等。传统的黑曲霉和米曲霉等真菌发酵产果胶酸内切水解酶工艺的主要缺点是产量较低，在自然条件下，真菌需要在果胶酸或果胶酸酯等底物的诱导下，才能产生果胶酸内切水解酶和其他果胶酶，在其他碳源如葡萄糖或蔗糖存在的条件下，果胶酶的表达会受到抑制。基因重组技术是解决葡萄糖或蔗糖等碳源抑制真菌果胶酶自然表达的有效方法，真菌果胶酸内切水解酶已经在丝状真菌中实现同源重组表达和在酵母菌中实现表达质粒重组表达，但表达效果比较差，产酶量约40U/mLmedium左右；相对于真菌表达系统而言，大肠杆菌表达系统是常用的、更为方便的表达系统，申请人在2007年用大肠杆菌表达系统实现了米曲霉果胶酸内切水解酶在大肠杆菌中的表达，表达效率70U/mLmedium，高于真菌表达系统，但是用大肠杆菌重组表达果胶酸内切水解酶工艺的主要缺点是产品容易混有内毒素，难以在食品工业进行广泛的应用，而且现有大肠杆菌表达米曲霉果胶酸内切水解酶的效率还有待进一步提高。
技术实现思路
本专利技术针对缺乏能够高效表达食品级果胶酸内切水解酶的质粒及工程菌，提供了一种高效原核表达食品级果胶酸内切水解酶的质粒及工程菌。本专利技术提供了一种能够在枯草芽孢杆菌中高效表达的果胶酸内切水解酶GSHS-NPG-SHS，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了编码果胶酸内切水解酶的基因，所述基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了一种表达所述果胶酸内切水解酶NPG或含有所述编码果胶酸内切水解酶蛋白NPG基因的表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体以pBSCWZ为出发载体，pBSCWZ载体的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述pBSCWZ载体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术提供了一种表达所述果胶酸内切水解酶GSHS-NPG-SHS的工程菌或细胞系。在本专利技术的一种实施方式中，所述工程菌或细胞系是以枯草芽孢杆菌B.subtilis800为宿主，表达如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种制备果胶酸内切水解酶的方法，所述方法是以表达果胶酸内切水解酶NPG的工程菌或细胞系为发酵菌株进行发酵产酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为将所述表达果胶酸内切水解酶NPG的基因工程菌或转基因细胞系的菌株接入含80～200μg/mL卡那霉素的LB培养基中35～40℃液体培养8h～16h得到菌液，将培养得到的菌液接入TB发酵液体培养基，35～40℃、150～250rpm培养至OD600到0.7～1.0，加入终浓度为0.3～0.5mMIPTG进行诱导，18～22℃培养，表达23～25h得到发酵液，将发酵液进行纯化得到所述果胶酸内切水解酶。本专利技术提供了一种所述果胶酸内切水解酶GSHS-NPG-SHS、表达果胶酸内切水解酶GSHS-NPG-SHS的基因工程菌或转基因细胞系在食品工业、生物能源工业和植物活性物质药物成分提取过程中的应用。本专利技术的有益效果：(1)提供了一种米曲霉果胶酸内切水解酶的食品级产品的原核重组表达的方法，本专利技术优化设计并合成了适合枯草芽孢杆菌表达系统的米曲霉果胶酸内切水解酶基因npg，构建高效表达果胶酸内切水解酶的表达质粒(npg/pBSCWZ)和工程菌(npg/pBSCWZ/B.subtilis800)。(2)NPG对宿主细胞生长影响较小。摇瓶发酵表达结果表明，30℃条件下表达24h后，npg/pBSCWZ/B.subtilis800工程菌OD600可以达到2.5，高于原始果胶酸内切水解酶独立表达的工程菌(OD600为1.30)。(3)本专利技术的工程菌表达的NPG具有较高的可溶性蛋白产量，表达蛋白的活性产量达到350U/ml。附图说明图1是npg/pBSCWZ表达质粒结构图。图2是npg/pBSCWZ双酶切的电泳图；泳道1为DNAmarker，泳道2为npg/pBSCWZ双酶切。图3是NPG蛋白电泳图；泳道1为蛋白Mark，泳道2为来自npg/pBSCWZ/B.subtilis800的上清蛋白，泳道3为来自npg/pBSCWZ/B.subtilis800的胞内沉淀，泳道4为来自pBSCWZ/B.subtilis800的胞内沉淀，泳道5为来自pBSCWZ/B.subtilis800的上清蛋白；箭头指向为目标蛋白。图4是NPG蛋白处理马铃薯块根组织块图；1是实验组，带杆箭头指向马铃薯块根组织块中被NPG水解中胶层果胶后释放的单细胞，2是对照组，箭头指向马铃薯块根组织块中细胞的之间未发生变化的中胶层，图中标尺长度代表50μm。具体实施方式以下通过实施例来进一步阐明本专利技术，下列实施例用于说明目的而非用于限制本专利技术范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。LB培养基：在1L去离子水中加入10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、5gNaCl，用1mol/LNaOH调节pH至7.4，121℃高压下蒸汽灭菌20min。TB培养基：甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO412.54g/L，KH2PO42.31g/L。果胶酶水解酶酶活测定方法(详细步骤参照王小敏等，分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究，食品工业科技分析检测Vol.28,No.05,2007)：0.5ml反应体系含有50mMHAc/NaAc(pH5.5)，1mg/mL果胶酸，适量的酶37℃条件下反应10min，为了检测反应体系中产生的还原糖的量，加0.5mL二硝基水杨酸(dinitrosalicylicacid，DNS)试剂终止反应，然后检测在520nm处的吸收值，再根据标准曲线回归方程，换算得到还原糖浓度，然后计算裂解细胞上清的每毫升体积所含的总酶活，再计算相对于每毫升菌体培养液体积的总酶活。一个酶活单位定义为每分钟释放的产物等同于1μmol半乳糖醛酸的酶量。实施例1npg基因设计及npg/PMD18T质粒构建利用来源于米曲霉果胶酸内切水解酶A的npg基因，对其基因序列进行35个密码子优化，使其适合枯草芽孢杆菌表达系统，并在其上下游分别融合编码特定多肽GSHS和SHS(SSSSHHHHHHHHSSS和SSHHHHSS)的核苷酸序列，在5’端添加NdeⅠ位点序列，在3’端加上SalⅠ位点序列，化学合成如SEQIDNO.1所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。将合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种果胶酸内切水解酶，其特征在于，所述果胶酸内切水解酶氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种果胶酸内切水解酶，其特征在于，所述果胶酸内切水解酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.编码权利要求1所述果胶酸内切水解酶的基因。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体表达权利要求1所述果胶酸内切水解酶或含有权利要求2所述基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
5.一种工程菌或细胞系，其特征在于，所述工程菌或细胞系能够表达权利要求1所述果胶水解酶，或表达权利要求2所述基因，或含有权利要求3～5任一所述表达载体。
6.根据权利要求5所述的工程菌或细胞系，其特征在于，所述工程菌或细胞系是以枯草芽孢杆菌B.subtilis800为宿主。
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵庆新，赵子润，朱华琛，康贻军，沈敏，刘忠权，
申请(专利权)人：盐城师范学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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