一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin及其应用，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO 01所示的序列，采用基因工程技术表达、纯化获得。本发明专利技术的抗菌肽的抗菌谱广、抗菌效果好、杀菌速率快，显示出极大的应用价值，在制备抗菌剂方面有良好的应用。本发明专利技术的抗菌肽对小鼠肝实质细胞AML12、人正常肝细胞L02等无细胞毒性，可安全用于药物治疗或者作为饲料组合物使用。

Scyreprocin, an antibacterial peptide from Eriocheir punctata and its application

【技术实现步骤摘要】
一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin及其应用
本专利技术属于甲壳动物基因工程
，具体涉及一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin及其应用。
技术介绍
为满足世界人口快速增长伴随对食品需求的增长，近年来畜禽、水产养殖业快速发展，大量抗生素被应用于产业以抵抗各类病原菌。抗生素的应用提高了饲料利用效率及产业经济效益，而抗生素的滥用也使病原微生物产生耐药性及二重感染，残留于养殖土壤及水体、畜禽水产产品中的抗生素使产品质量及安全性受到严重影响，威胁人类健康。因此，寻找高效、绿色抗生素替代品迫在眉睫，成为近年来的研究热点。安全高效、不产生抗药性、无残留和可体内降解的抗菌肽被认为是抗生素的理想替代品之一。抗菌肽(antimicrobialpeptide，AMP)又称宿主防御肽(hostdefensepeptide，HDP)，是由生物有机体产生具有抗菌活性或防御功能的小分子肽类物质，是动物体先天性免疫防御系统的重要组成部分。1972年，瑞典科学家Boman等首先在果蝇中发现抗菌肽及其免疫功能。1981年Boman等首次从美国天蚕(Hyalophoracecropin)中成功地分离到两种抗菌肽——天蚕素(Cecropin)A和B。此后，人们在植物、昆虫、两栖类、水产类以及哺乳类动物甚至一些细菌中都发现了抗菌肽类物质。迄今为止，大约有2800多种抗菌肽被分离出来，各种脊椎动物中已发现100多种。经过20多年的研究，人们对抗菌肽结构、功能及作用机制有了较深的认识。天然抗菌肽通常由12至100个氨基酸残残基组成，多具有强碱性、热稳定性及广谱抗菌等特点，不仅对细菌、部分真菌、原生动物、耐药性细菌具有杀灭作用，亦可选择性杀伤肿瘤细胞，抑制乙型肝炎病毒等的复制。迄今为止，研究者们发现抗菌肽可通过多种不同的作用机制发挥其活性功能，主要包括以下六个途径：①大多数抗菌肽(如天蚕素Cecropin，猪小肠分离得到的抗菌肽Cecp等)通过胞膜攻击作用破坏微生物或癌细胞质膜结构，引起内容物大量渗出，最终导致肿瘤细胞和微生物的死亡；②某些抗菌肽(如融合抗菌肽DP1，抗菌肽RGDtachyplesin等)通过诱导细胞凋亡以杀灭肿瘤细胞；③人唾液抗菌肽MUC7及抗菌肽Thanatin通过攻击微生物线粒体，抑制细胞呼吸作用发挥其杀菌功能；④对抗菌肽dermaseptinS4进行改造后获得新型抗菌肽PVS4(13)可穿过细胞膜直接作用于肿瘤细胞染色质发挥杀伤作用；⑤天蚕素B、B1和B3不仅使癌细胞膜发生穿孔，还可以进一步破坏细胞微管的正常功能进而引起细胞骨架的完整性，阻止纺锤丝形成和游戏分裂的过程，破坏细胞器，最终杀伤肿瘤细胞；⑥人源抗菌肽β2defensin3通过抑制细菌蛋白质合成及细胞壁的形成，使细菌无法维持正常的形态、生长受阻，最终导致细菌细胞壁穿孔，内容物外泄，达到其杀菌的效果。以上已发现的大多数抗菌肽不仅对细菌有较强的抑杀效果，随着研究的深入开展，抗菌肽对真菌、原虫、病毒及癌细胞的杀伤能力受到广泛的关注，其中CecropinA、Magainin、Nisin等抗菌肽已先后在医药、食品和农业上得到了应用。抗菌肽作为新型抗菌物质，具有抗菌谱广、生物活性稳定等特点，其物理吸附、破坏微生物膜作用机制不易产生耐药性使其成为强有力的抗生素替代品。随着对抗菌肽结构及其作用机理的不断深入研究，更多新型、高效、广谱且低毒的抗菌肽及其改造产品将会在临床医学、饲料添加剂和畜禽水产养殖领域具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin。本专利技术的另一目的在于提供上述拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin的应用。本专利技术的技术方案如下：一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin，其氨基酸序列包括如SEQIDNO01所示的序列。其由84个氨基酸组成，来源于拟穴青蟹，是具有抗菌功能的多肽。该抗菌肽84个氨基酸中包含15个带正电荷的氨基酸残基和7个带负电荷的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为9.61，在pH等于7.0时带有7个正电荷。该抗菌肽的亲水性平均系数为-0.968，具有较强的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子抗菌肽。在本专利技术的一个优选实施方案中，其开放阅读框的核苷酸序列包括如SEQIDNO02所示的序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，其分子量为9107.258道尔顿，分子式为C396H636N106O127S4。本专利技术的技术方案之二：一种抗菌组合物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin。本专利技术的技术方案之三：一种饲料组合物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin。本专利技术的技术方案之四：一种防霉防腐组合物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin。本专利技术的技术方案之五：上述拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin在制备抗菌组合物中的应用。本专利技术的技术方案之六：上述拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin在制备饲料组合物中的应用。本专利技术的技术方案之七：上述拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin在制备防霉防腐组合物中的应用。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术的拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌及霉菌有显著的抗菌效果。其中，对河流弧菌的最小抑菌浓度为1-2μM，对重要致病菌施氏假单胞菌最小抑菌浓度为0.5-1μM、金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为＜0.5μM；对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的最小杀菌浓度为2-4μM。此外，对重要临床致病菌白色链球菌的最小抑菌浓度为2-4μM，新型隐球菌的最小抑菌浓度为1-2μM且最小杀菌浓度为8-16μM；对黑曲霉的最小抑菌浓度为4-8μM。因此与许多已知的海洋动物抗菌肽比较，其抗菌谱广、抗菌效果好、杀菌速率快，显示出极大的应用价值，在制备抗菌剂方面有良好的应用。2、本专利技术的拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin对小鼠肝实质细胞AML12、人正常肝细胞L02等无细胞毒性，可安全用于药物治疗或者作为饲料添加剂使用。附图说明图1为本专利技术实施例1中拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin的基因工程表达纯化图。在图1中，左图为菌株表达纯化、浓缩后获得的Scyreprocin蛋白SDS-PAGE电泳结果：M，蛋白Marker26616；1，诱导前菌株总蛋白；2，诱导24h后菌株总蛋白；3，菌株超声破碎细胞上清；4，纯化获得的Scyreprocin蛋白。右图为蛋白纯化峰图，箭头所指为Scyreprocin蛋白纯化峰。图2为拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin抑制黑曲霉孢子萌发检测的实验图。图3为拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin对新型隐球菌(左上)、白假丝酵母(左下)、施氏假单胞菌(右上)、溶壁微球菌(右下)的杀菌动力学曲线图。在图3中，横坐标为时间(min)，纵坐标为存活菌落数相对于起始菌落数的百分比。图4为MTS法检测拟穴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin，其特征在于：其氨基酸序列包括如SEQ ID NO 01所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin，其特征在于：其氨基酸序列包括如SEQIDNO01所示的序列。


2.如权利要求1所述的一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin，其特征在于：其开放阅读框的核苷酸序列包括如SEQIDNO02所示的序列。


3.如权利要求1所述的一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin，其特征在于：其分子量为9107.258道尔顿。


4.一种抗菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1至3中任一权利要求所述的拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin。


5.一种饲料组合物，其特征在于：其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王克坚，杨盈，陈芳奕，陈炎超，陈慧芸，彭会，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35