本发明专利技术公开了一种埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷或半乳糖苷化合物，是埃博霉素B 7‑O‑β‑D氮乙酰葡萄糖苷或是埃博霉素B 7‑O‑β‑D半乳糖苷。该化合物是由埃博霉素B和UDP‑O‑α‑N‑acetyl‑Dglucose或UDP‑O‑α‑D‑galactose与糖基转移酶BsGT‑1的Q318C或M296A突变蛋白介导糖基化反应获得。本发明专利技术还公开了该两种化合物在制备预防和治疗肝癌的药物中的应用。实验证实本发明专利技术的化合物埃博霉素B 7‑O‑β‑D半乳糖苷在浓度为1.09μM时，对人肝癌细胞HepG2有半抑制作用；并且对正常肝细胞HL7702的毒性相比于埃博霉素B原药下降了3116倍。上述糖苷有望增益埃博霉素在抗肿瘤活性中的应用价值，提升社会效益和经济价值。
N-acetylglucoside or galactoside compounds of ebomycin B and their enzymatic preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷或半乳糖苷化合物及其酶法制备与应用
本专利技术涉及一组埃博霉素B糖苷化合物及其酶法制备与应用，尤其涉及埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷或半乳糖苷化合物及其酶法制备，以及该类埃博霉素B糖苷化合物在制备治疗和预防肝癌的药物中的应用。属于微生物技术及其制品与应用
技术介绍
纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌。能够产生丰富的次级代谢产物，属粘球菌目，堆囊菌亚目，堆囊菌科，堆囊菌属。埃博霉素(Epothilone)是一类16元大环内酯类化合物，目前仅来源于纤维堆囊菌。埃博霉素与紫杉醇都是通过聚合微管蛋白而抑制肿瘤生长，但埃博霉素对多重耐药的肿瘤细胞尤其是紫杉醇耐药的肿瘤细胞表现出更好的抑制活性，并且具有大规模发酵生产的潜力，被认为是紫杉醇良好的替代品。该类化合物有两种主产物，分别是埃博霉素A和埃博霉素B，其结构式如下：Epothilone结构式(R＝H，epothiloneA；R＝CH3，epothiloneB)埃博霉素的化学结构相比于紫杉醇更为简单，其包含一个16元的大内酯环、一个三元氧环、以及一个噻唑环侧链。埃博霉素的类似物结构骨架基本相同，埃博霉素B比A在大环内酯的12位碳上多了一个甲基基团，使得对肿瘤细胞的抑制活性显著提高。目前，埃博霉素B的类似物伊沙匹隆(Ixabepilone)被FDA批准进行乳腺癌的治疗，除伊沙匹隆外，还有多种埃博霉素类似物进入不同的临床评估阶段，例如，帕土匹龙(Patupilone)，埃博霉素D(KOS-862),ZK-EPO以及ABJ879。尽管如此，以上报道的埃博霉素类似物均存在较强的神经毒性，血液毒性或是水溶性差等问题，这使得埃博霉素临床应用时受到限制。基于此，对埃博霉素的结构进行合理的后修饰改造十分必要。由糖基转移酶催化的天然产物糖基化修饰在自然界中广泛存在，所引入的糖基往往对化合物的水溶性、稳定性、以及生物活性方面都有重要的改善作用。对于埃博霉素的糖基化修饰的报道，仅限于2010年发现的EpothiloneosideA以及2014年报道的埃博霉素A7-O-β-D葡萄糖苷(EpothiloneA7-O-β-Dglucoside)。然而，对于抗肿瘤活性更好的埃博霉素B的糖基化，仅有有机化学合成的galactosylatedEpothiloneB，或者埃博霉素B3-O-α-D阿拉伯吠喃糖苷，其他类型糖基化产物尚未见报道。此外，有机化学方法合成EpothiloneB糖基化产物步骤复杂繁琐(galactosylatedEpothiloneB在化学合成过程中引入额外的衍生基团)，副产物多，分离纯化困难，且还存在有机化学合成方法难度大、合成条件要求高，很难做到选择性保护等缺陷。鉴于此，迫切需要找到更好的对埃博霉素B这一重要的抗肿瘤药物的多样的糖基化修饰替代方法，并能制备出种类更为丰富的埃博霉素B糖基化产物。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷或半乳糖苷化合物及其酶法制备，以及该类埃博霉素B糖苷化合物在制备治疗和预防肝癌的药物中的应用。本专利技术所述的埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷或半乳糖苷化合物，其特征在于，所述埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷化合物是化合物1：埃博霉素B7-O-β-D氮乙酰葡萄糖苷；所述埃博霉素B的半乳糖苷化合物是化合物2：埃博霉素B7-O-β-D半乳糖苷；所述化合物结构式及其连接方式和相应名称如下：其中：所述埃博霉素B的半乳糖苷化合物优选是化合物2：埃博霉素B7-O-β-D半乳糖苷。本专利技术所述的埃博霉素B氮乙酰葡萄糖苷或埃博霉素B半乳糖苷酶法制备的方法是：埃博霉素B氮乙酰葡萄糖苷酶法制备：以如下比例量，在50mMTris-HCl,10mMMgCl2的缓冲液环境下，以终浓度为10mM的埃博霉素B和终浓度为50mM的UDP-O-α-DN-acetyl-glucose与500μg/ml的糖基转移酶BsGT-1的Q318C突变蛋白进行体外酶活反应实验；埃博霉素B半乳糖苷酶法制备：以如下比例量，在50mMTris-HCl,10mMMgCl2的缓冲液环境下，以终浓度为10mM的埃博霉素B和终浓度为50mM的UDP-O-α-D-galactose与500μg/ml的糖基转移酶BsGT-1的M296A突变蛋白进行体外酶活反应实验；分别将以上反应混合液在37±1℃孵育12±2小时，然后添加3倍体积量的甲醇终止反应，14000r/min，30min去除蛋白沉淀，对样品旋转蒸干处理，再添加甲醇重悬产物，14000r/min再次离心30min后将产物通过半制备液相进行分离纯化；色谱柱尺寸规格选YMC-PackProC18,250mm×10.0mm,5μm；流动相体系：以35:65乙腈水系统洗脱，埃博霉素B糖苷的出峰时间：化合物1：13.9min；化合物2：14.4min；分离后的糖苷化合物分别蒸干，用CD3OD溶解，再使用UHPLC-ESI-Q-TOF高分辨质谱和核磁共振分别进行鉴定；其中，所述的糖基转移酶BsGT-1的Q318C突变蛋白是以pET28a-BsGT-1重组质粒为模板，设计突变引物为：F-Q318C：GTATGAGtgcGAGCTCACTGCAAATCGGGTTG；R-Q318C：TGAGCTCgcaCTCATACATTTGCGGAATGACG；通过一次PCR产生线性重组突变质粒片段，再通过重组反应环化，形成Q318C突变的pET28a-BsGT-1重组质粒，经重组质粒的转化和蛋白的诱导表达及纯化获得。同样，糖基转移酶BsGT-1的M296A突变蛋白获取与糖基转移酶BsGT-1的Q318C突变蛋白获取步骤一致，设计突变引物为：F-M296A：GGGgcaAACAGTACGATGGAAGCGATGAACGC；R-M296A：ATCGTACTGTTtgcCCCGCCATGAGAGATGAACA；上述的糖基转移酶BsGT-1(CUB50191)，其蛋白序列已经公布，其是通过提取B.subtilisJRS11基因组，设计引物(F-BamHI：CGCGGATCCATGAAAAAGTACCATATTTCGAT；R-SalI：ACGCGTCGACTTACTGCGGGACAGCGGATTTTT)，经过双酶切连接形成pET28a-BsGT-1重组质粒，由重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达获得。上述埃博霉素B氮乙酰葡萄糖苷或埃博霉素B半乳糖苷酶法制备的方法中：所述埃博霉素B和UDP-O-α-N-acetyl-Dglucose或UDP-O-α-D-galactose混合的摩尔比优选为1:5，其与糖基转移酶BsGT-1的Q318C或M296A突变蛋白介导糖基化反应的反应混合液优选在37℃孵育12小时。本专利技术所述埃博霉素B氮乙酰葡萄糖苷或埃博霉素B半乳糖苷化合物在制备预防和治疗肝癌的药物中的应用。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷或半乳糖苷化合物，其特征在于，所述埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷化合物是化合物1：埃博霉素B 7-O-β-D氮乙酰葡萄糖苷；所述埃博霉素B的半乳糖苷化合物是化合物2：埃博霉素B 7-O-β-D半乳糖苷。/n
【技术特征摘要】
1.一种埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷或半乳糖苷化合物，其特征在于，所述埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷化合物是化合物1：埃博霉素B7-O-β-D氮乙酰葡萄糖苷；所述埃博霉素B的半乳糖苷化合物是化合物2：埃博霉素B7-O-β-D半乳糖苷。
2.根据权利要求1所述的埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷或半乳糖苷化合物，其特征在于：所述埃博霉素B的半乳糖苷类化合物是化合物2：埃博霉素B7-O-β-D半乳糖苷。
3.权利要求1或2所述埃博霉素B的氮乙酰葡萄糖苷或半乳糖苷化合物酶法制备的方法，步骤是：
埃博霉素B氮乙酰葡萄糖苷酶法制备：以如下比例量，在50mMTris-HCl,10mMMgCl2的缓冲液环境下，以终浓度为10mM的埃博霉素B和终浓度为50mM的UDP-O-α-DN-acetyl-glucose与500μg/ml的糖基转移酶BsGT-1的Q318C突变蛋白进行体外酶活反应实验；
埃博霉素B半乳糖苷酶法制备：以如下比例量，在50mMTris-HCl,10mMMgCl2的缓冲液环境下，以终浓度为10mM的埃博霉素B和终浓度为50mM的UDP-O-α-D-galactose与500μg/ml的糖基转移酶BsGT-1的M296A突变蛋白进行体外酶活反应实验；
分别将以上反应混合液在37±1℃孵育12±2小时，然后添加3倍体积量的甲醇终止反应，14000r/min，30min去除蛋白沉淀，对样品旋转蒸干处理，再添加甲醇重悬产物，14000r/min再次离心30min后将产物通过半制备液相进行分离纯化；色谱柱尺寸规格选YMC-PackProC18,250mm×10.0mm,5μm；流动相体系：以35:65乙腈水系统洗脱，埃博霉素B糖苷的出峰时间：化合物1：13.9min；化合物2：14.4min；分离后的糖苷化合物分别蒸干，用CD3OD溶解，再使用UHPLC-ESI-Q-TOF高分辨质谱和核磁共振分别进行鉴定；
【专利技术属性】
技术研发人员：李越中，张鹏，吴长生，汤亚杰，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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