一种化学交联剂及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种氨基酸骨架结构、同时具有同位素标记及富集功能的化学交联剂及其制备方法和应用。氨基酸骨架具有不同的碳链长度，包括两种天然氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；三种非天然氨基酸：2‑氨基‑1,6‑己二酸、2‑氨基‑1,7‑庚二酸、2‑氨基‑1,8‑辛二酸。氨基酸骨架引入同位素标记，包括氘、碳13或氮15的一种或两种以上。交联剂修饰化学富集基团，包括炔基、叠氮或生物素中的一种。本发明专利技术化学交联剂为实现细胞内原位蛋白复合体的规模化分析、细胞内亚细胞器蛋白质复合物规模化分析、细胞内原位目标蛋白质复合物分析、蛋白质的空间结构解析、蛋白质‑蛋白质相互作用解析以及蛋白质时空动态变化分析提供重要的技术支撑。

A chemical crosslinker and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种化学交联剂及其制备和应用
本专利技术涉及一种氨基酸骨架结构、同时具有同位素标记及富集功能的化学交联剂及其制备方法和应用。本专利技术交联剂采用不同碳链长度的氨基酸为骨架结构，具体包括两种天然氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；三种非天然氨基酸：2-氨基-1,6-己二酸、2-氨基-1,7-庚二酸、2-氨基-1,8-辛二酸。氨基酸骨架引入同位素标记，包括氘、碳13或氮15的一种或两种以上。交联剂修饰化学富集基团，包括炔基、叠氮或生物素的一种。该专利技术属于有机合成

技术介绍
近年来，化学交联剂结合质谱技术兴起，成为一种研究蛋白质复合物结构以及蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具。该方法相比酵母双杂交、免疫共沉淀、蛋白质结晶X射线衍射等传统方法(TrendsBiotechnol,2016,34,825-834.；JournalofCellularBiochemistry,2016,117,2109-2117.)具有分析迅速、灵敏度高、通量高、可处理细胞裂解液、完整细胞及组织蛋白样品等优点，因而成为持续增长的新的研究热点(MassSpectrometryReviews,2010,29,862-876；AnalyticalChemistry,2016,88,7930-7937；JournalofProteomeResearch,2017,1,722.)。化学交联剂的设计与合成，为化学交联剂结合质谱技术提供重要的技术支撑。一般而言，化学交联剂包含两个反应活性基团以及合理的间隔臂长。目前反应活性基团最常采用的是琥珀酰亚胺酯结构，可以特异性地与蛋白质或多肽赖氨酸末端或N端氨基反应，反应条件温和、高效。交联反应后的蛋白质再经过酶解即可得到交联肽。由于交联肽在常规肽(未交联的多肽)中占有率小，丰度低，为实现交联肽的高通量分析，人们在交联剂的设计过程中引入富集基团。目前较为常见的富集基团包括炔基、叠氮以及生物素基团(JournalofProteomeResearch,2009,8,3702-3711；JournaloftheAmericanChemicalSociety,2003,9,241625；Molecular&CellularProteomics,2014,13,3533.)。其中炔基可以与含有叠氮的磁球发生点击化学反应，实现交联肽高效富集；同理，叠氮可以与含有炔基的磁球发生点击化学反应，实现交联肽高效富集；生物素单元可以采用含有链霉亲和素的磁球，实现交联肽高效富集。细胞或组织蛋白原位交联可以提供更真实的蛋白结构及蛋白-蛋白相互作用信息，是化学交联质谱技术的热点研究领域(CurrentOpinioninChemicalBiology,2019,48,8；Methods,2018,15,144；CellChemicalBiology,2017,25,1)。为了实现化学交联剂的穿膜特性，将化学交联剂设计成电中性、疏水结构是主要的方法，如报道较多的Disuccinimidylsuberate(简称DSS)、Disuccinimidylsulfoxide(简称DSSO)均具有很好的穿膜特性。美国华盛顿大学的Bruce课题组在交联剂的设计方面做出了突出的工作，他所设计的化学交联剂(统一命名为PIR)均以多肽链为骨架结构，得到了较好的交联效果(MolecularBiosystems,2010,6,939；NatureCommunications,2016,7,13414；PNAS,2017,114,1732.)。然而，由于交联剂具有大的骨架结构，引入更多的空间位阻，不利于蛋白内部的化学交联。2018年，Heck课题组利用小尺寸的DSSO交联剂应用于细胞线粒体蛋白交联，得到的交联肽数目、交联蛋白数目均多于PIR交联剂，说明尺寸小的交联剂具有更小的位阻、更灵活的优势，因而也是未来交联剂的发展趋势(Molecular&CellularProtomics,2018,17,216.)。化学交联剂引入同位素标记，可以实现化学交联质谱技术与定量蛋白组学技术相结合，获取细胞内蛋白的时空动态变化信息，为生命科学领域提供更有力的技术支撑(CurrentOpinioninChemicalBiology,2019,48,8)。
技术实现思路
基于上述化学交联剂的研究现状及设计原则，本专利技术设计并合成了一种氨基酸骨架结构、具有同位素标记及富集功能的化学交联剂。本专利技术氨基酸骨架具有不同的碳链长度，具体包括两种天然氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；三种非天然氨基酸：2-氨基-1,6-己二酸、2-氨基-1,7-庚二酸、2-氨基-1,8-辛二酸。氨基酸骨架引入同位素标记，包括氘、碳13或氮15的一种或两种以上，实现化学交联质谱技术与定量蛋白组学技术相结合。氨基酸末端羧基引入琥珀酰亚胺酯活性基团，能够高效温和地和蛋白、多肽赖氨酸末端或N端氨基发生交联反应，实现蛋白质的快速交联。另外，针对交联肽在常规肽中占有率小、丰度低的问题，本专利技术在交联剂中引入富集基团，包括炔基、叠氮或生物素，实现交联肽的富集，提高其在质谱中的响应，实现交联肽的高通量、高灵敏度分析。化学交联剂具有电中性、疏水结构，满足交联剂的穿膜要求，能够实现细胞内蛋白原位化学交联，获取高可信度的蛋白三维结构以及蛋白-蛋白相互作用信息。本专利技术提供的一种氨基酸骨架、具有同位素标记及富集功能的化学交联剂，结构如下：氨基酸骨架包括由两个酯羰基及之间的碳链以及氨基部分构成。其中，n取值范围为1-5，对应不同碳链长度的氨基酸骨架；氨基酸骨架引入不同的同位素标记，包括氘、碳13或氮15的一种或两种以上；R为化学富集基团，包括炔基、叠氮或生物素的一种。具体包含15种结构，如下：天冬氨酸骨架、不同富集基团的化学交联剂，具有如下结构：谷氨酸骨架、不同富集基团的化学交联剂，具有如下结构：2-氨基-1,6-己二酸骨架、不同富集基团的化学交联剂，具有如下结构：2-氨基-1,7-庚二酸骨架、不同富集基团的化学交联剂，具有如下结构：2-氨基-1,8-辛二酸骨架、不同富集基团的化学交联剂，具有如下结构：其中，上述15种化学交联剂均可以在氨基酸骨架上引入同位素标记，包括氘、碳13、氮15的一种或两种以上。本专利技术提供了化学交联剂的制备方法，具体步骤如下：第一步，富集基团酰氯试剂的制备。将具有富集基团的羧酸溶于无水二氯甲烷中，加入0.01-0.1mLDMF，反应液降温至0-5℃，取乙二酰氯滴加至反应液，乙二酰氯与富集基团的羧酸摩尔比控制在(1-1.5)：1，滴毕，反应液升温至15-25℃，继续反应1-2h，即制得具有富集基团的酰氯试剂；第二步，修饰富集基团的二羧酸化合物的制备。将不同碳链长度或同位素标记的氨基酸溶于饱和的碳酸氢钠中，氨基酸与碳酸氢钠摩尔比控制在1：(3-5)，反应液降温至0-5℃，滴加步骤一新制备的具有富集基团的酰氯试剂，氨基酸与富集基团酰氯试剂摩尔比控制在1：(1.1-1.3)，滴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化学交联剂，其特征在于：同时具有氨基酸骨架、同位素标记以及富集功能基团，其结构式为：/n

【技术特征摘要】
1.一种化学交联剂，其特征在于：同时具有氨基酸骨架、同位素标记以及富集功能基团，其结构式为：



其中，n取值范围为1-5，对应不同碳链长度的氨基酸骨架；氨基酸骨架引入同位素标记，包括氘、碳13或氮15中的一种或两种以上；R为化学富集基团，包括炔基、叠氮或生物素中的一种。


2.根据权利要求1所述的化学交联剂，其特征在于：
以不同碳链长度的氨基酸为骨架结构，包括两种天然氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；三种非天然氨基酸：2-氨基-1,6-己二酸、2-氨基-1,7-庚二酸、2-氨基-1,8-辛二酸；氨基酸骨架引入同位素标记，包括氘、碳13或氮15中的一种或两种以上，实现化学交联质谱技术与蛋白组学定量技术结合，获取细胞内蛋白的时空动态变化信息；化学交联剂具有两个琥珀酰亚胺酯结构单元，高效温和地与蛋白质、多肽赖氨酸末端或N端氨基发生反应，实现蛋白质的快速交联；化学交联剂具有化学富集基团，包括炔基、叠氮或生物素中的一种，通过富集方式提高交联肽在质谱中的响应，实现交联肽高通量、高灵敏度分析；化学交联剂具有电中性、疏水结构，交联剂穿过细胞膜到达细胞质及各个亚细胞器，实现细胞内蛋白原位化学交联，获取高可信度的蛋白三维结构以及蛋白-蛋白相互作用信息。


3.根据权利要求1所述的化学交联剂的制备方法，其特征在于，具体过程如下：
(1)
(2)
(3)
步骤一，具有富集基团R的羧酸为起始原料，乙二酰氯为酰化试剂，N,N-二甲基甲酰胺，以下简称DMF，为催化剂，无水二氯甲烷为反应溶剂，制备富集基团酰氯试剂；
步骤二，以1-5不同碳链长度或同位素标记的氨基酸为原料，在饱和碳酸氢钠溶液中，与步骤一新制备的富集基团酰氯发生酰胺化反应，浓盐酸调反应液为酸性，制备修饰富集基团的二羧酸化合物；
步骤三，以步骤二制备的修饰富集基团的二羧酸化合物为原料，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，以下简称EDCI，为缩合剂，与N-羟...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，高航，赵群，安雨馨，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21