突变纤维素酶和无机物添加剂在玉米青贮发酵中的应用制造技术

本发明专利技术提供了突变纤维素酶和无机物添加剂在玉米青贮发酵中的应用；提供了一种玉米青贮添加剂，其包含氨基酸序列为SEQ ID NO.3的突变纤维素酶、膨润土和高岭土成分；本发明专利技术的玉米青贮添加剂能在寒冷条件下有效促进乳酸菌等有益菌生长并改善青贮玉米品质。

Application of mutant cellulase and inorganic additives in corn silage fermentation

【技术实现步骤摘要】
突变纤维素酶和无机物添加剂在玉米青贮发酵中的应用
本专利技术属于酶工程领域和饲料青贮领域，具体地，本专利技术提供了突变纤维素酶和无机物在玉米青贮发酵中的应用，即提供了一种玉米青贮添加剂，其包含氨基酸序列为SEQIDNO.3的突变纤维素酶、膨润土和高岭土成分；本专利技术的玉米青贮添加剂能在寒冷条件下有效促进乳酸菌等有益菌生长并改善青贮玉米品质。
技术介绍
青贮是指在密封条件下，通过青贮原料上附着的乳酸菌等厌氧发酵将碳水化合物转化成以乳酸为主的有机酸，使pH下降，抑制有害菌的生长，从而使饲料得以长期保存并优化其营养价值的过程。自古以来青贮就是寒冷地区畜牧业饲料的主要来源之一，可以青贮的饲料主要有玉米、苜蓿、大麦、燕麦、高粱、紫云英、甜菜、马铃薯等，玉米为我国北方主要饲料青贮品种。为了提高青贮饲料的质量，玉米青贮中可以添加各种添加剂，常见的添加剂包括酶添加剂、微生物添加剂、化学添加剂等，其中酶添加剂可以辅助饲料中纤维素等多糖成分的降解，帮助微生物生长并提高饲料的营养价值，化学添加剂（主要为尿素等有机添加剂）能有利于有益菌生长，且酶添加剂和化学添加剂没有微生物添加剂容易受到气候条件、发酵条件、保存条件影响的缺点（如在东北寒区地区青贮时，微生物添加剂效果即不明显），是较实用的青贮添加剂选择。酶添加剂中常用的酶为纤维素酶，也有使用半纤维素酶和果胶酶等的报道。现有纤维素酶的问题主要在于：首先，虽然商品化大量生产的纤维素酶多已属于中性略偏酸性酶，但这些酶在pH4以下(优质玉米青贮饲料的pH范围)的表现一般不佳，酶活一般不足50%；其次，这些现有纤维素酶的最适温度一般较高，在30-40℃的发酵温度下（我国东北地区等寒带的发酵温度甚至可能更低），酶活也往往损失过半；化学添加剂虽然能促进有益菌生长，但对青贮失败/品质低下的主要起因—有害菌并无作用。综上，寻找新的纤维素酶以提高玉米青贮中酶添加剂的效果，并寻找抑制有害菌的方法是本领域的普遍追求之一。
技术实现思路
申请人在现有适用纤维素酶的基础上，通过易错PCR的方式筛选到了一种适低温适低pH的纤维素酶突变体，其用于玉米青贮时能有效改善饲料产品在感官、pH和有机酸方面的品质；此外，申请人发现在青贮添加剂中加入一定量的膨润土和高岭土成分能在有氧发酵阶段吸附大量繁殖的有害菌（进入无氧阶段时吸附能力趋于饱和）以及重金属等毒性成分（推测），从而抑制有害菌并促进有益菌生长。一方面，本申请提供了膨润土和高岭土在玉米青贮发酵中的应用。进一步地，所述膨润土和高岭土重量比例为3-5:1-3。进一步地，所述膨润土和高岭土重量比例为3：1。进一步地，玉米青贮中还添加纤维素酶。进一步地，所述纤维素酶氨基酸序列为SEQIDNO.3。进一步的，所述膨润土和高岭土添加量为3g/500g玉米和1g/500g玉米。进一步地，所述纤维素酶添加量为5000-7000U/500g玉米。另一方面，本申请提供了一种玉米青贮添加剂，其包含膨润土和高岭土。进一步地，膨润土和高岭土重量比例为3-5:1-3。进一步地，所述膨润土和高岭土重量比例为3：1进一步地，玉米青贮添加剂中还包含纤维素酶。进一步地，所述纤维素酶氨基酸序列为SEQIDNO.3。本申请的纤维素酶突变体可以使用对应的编码基因在任何适合的宿主菌中表达生产，包括但不限于里氏木霉，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母菌，本领域技术人员可以根据分子生物学一般知识对基因进行相应改造以提高表达效果。可以将其发酵产物，发酵产物的提纯品或者工程宿主菌用于玉米青贮中。本申请中的膨润土和高岭土不限于具体产地和组分，应用不同产地和组分的膨润土和高岭土时本领域技术人员可以本领域常规技术确定适合的用量/比例。本申请中的玉米品种不限于实施例中的使用的品种，各种现有和未来开发的青贮专用、粮饲兼用玉米均可使用。本申请的应用和添加剂产品中不排斥使用其他添加剂成分，包括但不限于微生物添加剂和有机/无机物添加剂。附图简述图1为野生型和突变型纤维素酶的适合作用温度比较图；图2为野生型和突变型纤维素酶的适合作用pH比较图。实施例实施例1突变酶的筛选、表达和酶学性质此部分研究由合作单位完成委托合作单位从现有纤维素酶(氨基酸序列为SEQIDNO.1、核苷酸序列为SEQIDNO.2，已尝试用于饲料青贮)的基础上以易错PCR构建突变酶文库（GeneMorphIIrandommutagenesiskit），进而筛选所需的低pH低温适用纤维素酶。筛选出的突变型纤维素酶氨基酸序列为SEQIDNO.3、核苷酸序列为SEQIDNO.4，经过比较其49位置上Thr突变为Lys、66位置上Ala突变为Pro、81位置上Cys突变为Ala、145位置的Phe突变为Ser、146位置上的Asp突变为Gly。在MM培养基中发酵48h后（经过初步优化的发酵条件），表达野生型纤维素酶里氏木霉工程菌的发酵液酶活为65U/mL，而表达突变型纤维素酶里氏木霉工程菌的发酵液酶活为63U/mL（酶活单位标准为：pH4.8，50℃时每分钟从浓度为5mg/ml的羟甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位），两者基本在同一水平上，该突变型纤维素酶可用于实际生产。测试了野生型纤维素酶和突变型纤维素酶的适合作用温度，结果如图1所示：显示相比野生型，突变的纤维素酶的最适温度明显下移，在类似青贮的较低温度下的活性明显提高，在35-45℃之间仍然保持38-75%的活性。测试了野生型纤维素酶和突变型纤维素酶的适合作用pH，结果如图2所示：显示相比野生型，突变的纤维素酶的最适pH明显低移，在青贮期pH4左右的pH下活性明显提高，保持了60%左右的活性，明显高于野生型的40%左右。以下部分由申请人自行完成：材料、仪器和试剂青贮玉米品种和基本处理过程：选择东北地区常用的中原单32号品种，实验过程所用的玉米来自固定种植基地的同批次玉米，品质基本一致（平均株高约230cm，平均果穗长约24cm，种植密度3800株/亩）。玉米收获期为抽丝期第40-43日，留茬高度为30cm，切割长度约2cm。饲料用钙基膨润土：购于河北灵寿县某矿场品加工厂。水洗高岭土：购于河北灵寿县某矿场品加工厂。pH计：CT-6020A便携式pH计（柯迪达电子制造）。离子色谱仪：ICS-2500离子色谱仪（DIONEX制造）。纤维分析仪：A2000i纤维分析仪（ANKOM制造）。定氮仪：KDN-08A凯式定氮仪（杭州汇尔制造）其他试剂和仪器均为常规国产型号。实施例2添加膨润土、高岭土和纤维素酶对青贮玉米品质的影响实验共设置6组：组1：不添加添加剂进行青贮；组2：每瓶加入表达野生型纤维素酶里氏木霉工程菌的发酵液100mL（约6500U）；组3：每瓶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.膨润土和高岭土在玉米青贮发酵中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.膨润土和高岭土在玉米青贮发酵中的应用。


2.根据权利要求1的应用，其中所述膨润土和高岭土重量比例为3-5:1-3。


3.根据权利要求1或2的应用，其中玉米青贮发酵中还添加纤维素酶。


4.根据权利要求3的应用，其中所述纤维素酶氨基酸序列为SEQIDNO.3。


5.根据权利要求2-4任一项的应用，其中所述膨润土和高岭土添加量为3g/500g玉米和1g/500g玉米。

【专利技术属性】
技术研发人员：李旭业，
申请(专利权)人：李旭业，
类型：发明
国别省市：黑龙;23