一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，属于组织培养技术领域，本发明专利技术通过以MS为基本培养基，研究添加不同2,4‑D浓度及营养成分对GT42胚性愈伤组织的影响。进而优化GT42胚性愈伤组织的诱导培养基，培养优质的胚性愈伤组织，为甘蔗的遗传转化提供优质材料，并为甘蔗的快速繁殖提供技术保障，以MS为基本培养基，添加3mg/L 2,4‑D为最佳培养基，胚性愈伤诱导率达71.06％。在试验1的基础上，以添加100ml/L椰汁最佳，胚性愈伤诱导率达84.22％。本研究通过设计优化试验，筛选出了诱导胚性愈伤组织的最佳培养基，为甘蔗的快速繁殖及遗传转化提供了一定的研究基础。

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法
本专利技术涉及组织培养
，尤其涉及一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法。
技术介绍
甘蔗是我国最重要的糖料作物，甘蔗糖占全国食糖总产量90％以上，其中广西占全国60％以上，对广西乃至我国的经济发展具有重要意义。由于甘蔗是高度杂合的非整倍性异源多倍体植物，遗传背景相当复杂，甘蔗育种以杂交育种为主，利用传统育种方法从有性杂交到良种育成的周期长、成效低，一般育成一个品种需要10年左右的时间。转基因辅助育种可以有效的提高甘蔗育种效率，缩短育种年限。在甘蔗的遗传转化中主要使用的方法有农杆菌介导法和基因枪轰击法，通过上述两种方法，已获得抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、高糖等转基因甘蔗。不论是农杆菌介导法还是基因枪轰击法，其转化的受体都是胚性愈伤组织。因而获得良好的胚性愈伤组织是遗传转化最基本的保障。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，解决甘蔗的遗传转化中无法获得缺乏良好胚性愈伤组织的技术问题。一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，所述方法包括如下步骤：步骤1：从田间选取生长健壮的甘蔗植株尾梢，剥掉叶片，留取28-32cm的尾梢带回实验室；步骤2：用75％乙醇消毒尾梢表面，剥除4-5层外叶鞘后置于超净工作台内，取距顶端生长点9-11cm的幼嫩心叶组织作为外植体，将其切成0.18-0.22mm厚的薄片接种于愈伤组织诱导培养基上；步骤3：培养皿的数量为6个，每个培养皿接种10块外植体，27℃暗培养15～20d；步骤4：二十天后观察诱导出的愈伤组织，将愈伤组织转接至新的培养基中继代培养；步骤5：继代后第二十天观察，统计继代培养后的愈伤组织诱导率、褐化率和污染率，选出适合诱导胚性愈伤组织。进一步地，所述步骤1中，甘蔗植株选用型号为GT42的甘蔗。进一步地，所述步骤2中，培养基以MS培养基为基本培养基，加30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH值5.8，培养皿中2,4-D浓度分别为：0mg/L，1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L，每个处理接20块外植体，3次重复。进一步地，所述步骤3中，接种外植体时，每个处理3个重复，每个重复接20个外植体。进一步地，所述步骤5中，统计愈伤组织诱导率、褐化率和污染率的具体算式为：愈伤组织诱导率(％)＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体块数×100；外植体褐化率(％)＝外植体褐化数/接种外植体块数×100；外植体污染率(％)＝外植体污染数/接种外植体块数×100；进一步地，所述步骤3还包括在浓度3mg/L的2,4-D的培养基上分别添加不同的营养成分，第一个为0.5g/L水解酪蛋白，第二个为100ml/L椰汁，第三个为0.5g/L水解酪蛋白和100ml/L椰汁，每个处理接20块外植体，3次重复。在植物组织的生长过程中添加有机氮源及天然提取物对其生长有着良好的促进作用。MS培养基中唯一的有机氮源是甘氨酸。在植物组织培养中，使用水解酪蛋白(CaseinHydrolysate,CH)作为机氮源附加在MS培养基中，对愈伤组织的诱导有显著影响。前人研究认为0.10～1.00g/L的浓度比较适宜。在玉米幼穗愈伤组织培养中添加了CH，适量的CH具有提高胚性愈伤组织诱导率的作用。本试验中添加CH并未表现出对甘蔗愈伤组织的诱导作用，反而诱导率降低，其原因可能是CH的浓度不合适，抑或其不适宜甘蔗愈伤组织的诱导。其在甘蔗愈伤组织的诱导中的作用还需进一步探讨。椰汁(Coconutwater,CW)作为天然有机物被广泛应用于曼陀罗、文心兰、白及、甘蔗等植物组织培养中。在甘蔗愈伤组织分化阶段添加椰乳提高了愈伤组织的分化率；在幼苗生根阶段添加椰乳可以使苗增粗变壮，但并未对愈伤组织诱导阶段进行研究。对藏红花研究结果表明，添加100mL/LCW有助于愈伤组织的诱导，认为椰乳可能在愈伤组织诱导中增加天然组分营养，与合成成分相比具有保护愈伤组织的作用。本试验在确定了最佳2,4-D浓度的基础上，在原来的培养基中添加CW，结果表明，添加100ml/LCW时，胚性愈伤诱导率达84.22％，比未添加时诱导率提高了13.16％，说明添加CW能够很好的促进愈伤组织的生成。本专利技术采用了上述技术方案，本专利技术具有以下技术效果：本专利技术通过以MS为基本培养基，研究添加不同2,4-D浓度及营养成分对GT42胚性愈伤组织的影响。进而优化GT42胚性愈伤组织的诱导培养基，培养优质的胚性愈伤组织，为甘蔗的遗传转化提供优质材料，并为甘蔗的快速繁殖提供技术保障，以MS为基本培养基，添加3mg/L2,4-D为最佳培养基，胚性愈伤诱导率达71.06％。在试验1的基础上，以添加100ml/L椰汁最佳，胚性愈伤诱导率达84.22％。本研究通过设计优化试验，筛选出了诱导胚性愈伤组织的最佳培养基，为甘蔗的快速繁殖及遗传转化提供了一定的研究基础。附图说明图1是本专利技术不同激素浓度对愈伤组织诱导的影响结果图。图2是本专利技术的不同激素浓度对继代后胚性愈伤组织的影响结果图。图3是本专利技术的不同营养成分对愈伤组织诱导的影响结果图。图4是本专利技术的不同营养成分对胚性愈伤组织诱导的影响结果图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举出优选实施例，对本专利技术进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本专利技术的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本专利技术的这些方面。如图1所示，根据本专利技术的一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，以广西自育品种桂糖42号(GT42)的心叶为外植体，以MS为基本培养基，研究不同激素(2,4-D)浓度及营养成分(水解酪蛋白、椰汁)对胚性愈伤组织诱导的影响，进而优化GT42胚性愈伤组织诱导的培养基，培养优质的胚性愈伤组织，为甘蔗的遗传转化提供材料。结果表明：(1)以MS为基本培养基，添加3mg/L2,4-D为最佳培养基，胚性愈伤诱导率达71.06％。(2)在试验1的基础上，以添加100ml/L椰汁最佳，胚性愈伤诱导率达84.22％。本研究通过设计优化试验，筛选出了诱导胚性愈伤组织的最佳培养基，为甘蔗的快速繁殖及遗传转化提供了一定的研究基础。本研究以广西自育品种GT42为试验材料，以MS为基本培养基，研究添加不同2,4-D浓度及营养成分对GT42胚性愈伤组织的影响。进而优化GT42胚性愈伤组织的诱导培养基，培养优质的胚性愈伤组织，为甘蔗的遗传转化提供优质材料，并为甘蔗的快速繁殖提供技术保障。1.1试验材料供试材料为广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所自育品种GT42，由广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所提供，种植于广西甘蔗壮族自治区农业科学院甘蔗研究所试验基地。1.2试验方法1.2.1甘蔗愈伤组织的诱导从田间选取生长健壮的甘蔗植株尾梢，剥掉叶片，留取30cm左右的尾梢带回实验室，用75％乙醇消毒表面，剥除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：/n步骤1：从田间选取生长健壮的甘蔗植株尾梢，剥掉叶片，留取28-32cm的尾梢带回实验室；/n步骤2：用75％乙醇消毒尾梢表面，剥除4-5层外叶鞘后置于超净工作台内，取距顶端生长点9-11cm的幼嫩心叶组织作为外植体，将其切成0.18-0.22mm厚的薄片接种于愈伤组织诱导培养基上；/n步骤3：培养皿的数量为6个，每个培养皿接种10块外植体，27℃暗培养15～20d；/n步骤4：二十天后观察诱导出的愈伤组织，将愈伤组织转接至新的培养基中继代培养；/n步骤5：继代后第二十天观察，统计继代培养后的愈伤组织诱导率、褐化率和污染率，选出适合诱导胚性愈伤组织。/n

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤1：从田间选取生长健壮的甘蔗植株尾梢，剥掉叶片，留取28-32cm的尾梢带回实验室；
步骤2：用75％乙醇消毒尾梢表面，剥除4-5层外叶鞘后置于超净工作台内，取距顶端生长点9-11cm的幼嫩心叶组织作为外植体，将其切成0.18-0.22mm厚的薄片接种于愈伤组织诱导培养基上；
步骤3：培养皿的数量为6个，每个培养皿接种10块外植体，27℃暗培养15～20d；
步骤4：二十天后观察诱导出的愈伤组织，将愈伤组织转接至新的培养基中继代培养；
步骤5：继代后第二十天观察，统计继代培养后的愈伤组织诱导率、褐化率和污染率，选出适合诱导胚性愈伤组织。


2.根据权利要求1所述的一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤1中，甘蔗植株选用型号为GT42的甘蔗。


3.根据权利要求2所述的一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤2中，培养基以MS培养基为基本培养基，加30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH值5....

【专利技术属性】
技术研发人员：秦翠鲜，黄东亮，陈忠良，廖芬，汪淼，周丽，周建辉，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：广西;45