一种检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR引物组及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种检测鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR引物对及其检测方法。本方法通过设计并选择特异性的扩增鸭疫里默氏菌16S rRNA片段的引物，优化退火温度和反应条件，具有灵敏度高、特异性强的优点，可直接从鸭疫里默氏菌和感染鸭疫里默氏菌组织中扩增出特异性片段，并达到定量检测的目的，适合临床样本分子检测和诊断。

A fluorescent quantitative PCR primer set for detection of Riemerella anatipestifer and its detection method

【技术实现步骤摘要】
一种检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR引物组及其检测方法
本专利技术涉及兽医微生物分子检测
，更具体的涉及一种检测鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR方法及应用。
技术介绍
鸭传染性浆膜炎又名鸭疫里默氏病，是侵害鸭的一种急性败血性传染病，以全身浆膜面发生纤维素性炎症为特征，其发病率和死亡率均很高，急性病变多以死亡为转归，慢性病多会耐过，但会失去经济价值，已成为危害养鸭业的一种重要传染病。目前，鸭疫里默氏菌病的临床诊断主要的方法是血清学诊断(酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验)和常规PCR检测等。由于鸭疫里默氏菌血清学众多，目前已报道的有21中血清型，检测难度较大；常规PCR检测技术虽然较为常用，但灵敏性低于荧光定量PCR，易出现漏检的现象，而且只能定性，不能定量。SYBRGreenI实时荧光PCR使用一对特异性引物和SYBRGreenI核酸染料，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，无需电泳，以其速度快、灵敏度高、特异性强、自动化程度高、能定量等优点而被广泛应用于病原体检测。但目前缺乏特异性检测鸭疫里默氏菌的实时荧光定量PCR引物及检测方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种检测鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR方法，根据鸭疫里默氏菌16SrRNA保守序列设计特异性引物，经优化反应体系和条件，建立了检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR方法，该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点，可用于临床鸭传染性浆膜炎疑似病例样本的辅助诊断和检测。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：检测鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR方法，具体包括以下步骤：(1)以鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的16SrRNA为检测靶基因，设计特异性引物对，目标产物长度为163bp；(2)提取鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的总RNA，反转录为cDNA。(3)以步骤2中的cDNA为模板，以步骤1中引物对为引物，进行普通PCR扩增目的片段，产物纯化后构建重组质粒，并测序验证；(4)步骤(3)中测序验证正确的重组质粒进行浓度测定，10倍梯度稀释为不同浓度作标准品，-20℃保存备用；(5)以步骤(4)中的10倍梯度稀释的标准品质粒为模板，SYBRGreen染料法进行荧光定量PCR反应，建立起始模板拷贝数的对数与阈值循环数之间的标准曲线和标准方程；(6)将待测样品进行RNA提取和反转录为cDNA，然后使用步骤(1)中的引物对待测样品进行检测，将所测得的阈值循环数根据标准曲线即可计算出待测样品中鸭疫里默氏菌的拷贝数，即为待测样品中鸭疫里默氏菌的含量。进一步的，上述步骤(1)中，设计的特异性引物序列，上游引物：5’-ACTGCCGTTGATACTGCTA-3’，如SEQIDNO:1所示；下游引物：5’-TCTAATCCTGTTCGCTCCC-3’，如SEQIDNO:2所示；扩增目的片段为163bp，其核苷酸序列为：ACTGCCGTTGATACTGCTAGTCTTGAGTATAGTTGAGGTAGCTGGAATGAGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACTCAGAACACCGATTGCGAAGGCAGGTTACCAAGTTATAACTGACGCTGAGGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGA,如SEQIDNO.3所示。进一步地，在上述步骤(3)中，重组质粒的构建步骤为：A.将PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳；B.跑胶结束，紫外灯下观察，将含目的片段的凝胶进行切胶回收；C.胶回收试剂盒进行PCR胶回收和纯化；D.连接：PCR纯化产物与PMD-18T载体连接，其反应体系为：PCR纯化产物7μL，pGM-T载体1μL，T4连接酶1μL，10×LigationMix1μL。16℃水浴连接过夜；E.转化：将10μL连接产物加入DH5α细胞中，轻轻混匀放置10min，42℃热击90s，冰上放置2min后移入加有1ml无抗生素LB的1.5ml离心管中，置于37℃摇床中180rpm/min摇菌45min；F.涂板：取上述步骤F中的转化菌液100μL加入到含双抗的LB平板中，用三角棒涂抹均匀，置于37℃生化培养箱中过夜培养；G.阳性质粒鉴定：挑取步骤G过夜培养后的LB板中的菌落5个，进行菌落PCR鉴定，PCR鉴定阳性的菌液送生工生物公司测序，测序序列正确的为阳性质粒菌；H.阳性质粒的提取：测序正确的阳性质粒菌进行扩大培养后，质粒提取试剂盒提取质粒，测定质粒浓度。进一步的，上述步骤(4)中重组质粒浓度为56ng/μL，每μL质粒拷贝数按公式(质粒浓度ng/μL×10-9×6.02×1023)/(质粒DNA长度×660)转化为拷贝数，即(56×10-9×6.02×1023)/(163+2692)×660＝1.789×109拷贝/μL。进一步的，上述步骤(5)中，荧光定量PCR反应体系为：2×SuperRealPreMix10μL，50×RoxReferenceDye0.4μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL，cDNA模板2μL，ddH2O7.0μL。进一步的，上述步骤(5)中，荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性25s，62℃退火25s，72℃延伸30s，40个循环，在每次62℃结束时收集荧光信号；95℃30s，62℃退火30s，95℃30s，收集溶解曲线。进一步的，上述步骤(5)中标准曲线的建立方法为：以8个稀释浓度的标准品质粒DNA为模板，浓度分别为1.789×101-1.789×108拷贝/μL，用荧光定量PCR方法进行检测，利用荧光定量PCR仪自带的数据分析软件分析，建立起始模板拷贝数(X)的对数与CT值(Y)之间的标准曲线和标准方程。经数据经数据分析软件分析，以纵坐标(Y)代表CT值，横坐标(X)代表起始模板拷贝数，得到标准曲线方程为Y＝-3.319*LOG(X)+33.83，Eff.(扩增效率)和RSq(相关系数方值)分别为100.1％和0.997，各标准品的浓度对数与其CT值之间均呈良好的线性关系。由上述技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种检测鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR方法，该方法标准曲线线性关系良好，每反应2μL质粒标准品，定量范围为1.789×2×101-1.789×2×108拷贝/反应，即3.578×101-3.578×108拷贝/反应，最低检测限达35.78拷贝/反应，与常见的沙门氏菌和大肠杆菌无交叉反应，重复试验的变异系数为0.65％-1.9％。本专利技术还提供了一种基于鸭组织进行鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：(a)取鸭组织样品约50mg放入灭菌匀浆管中，加入TRNzol，置于匀浆器中匀浆，按TRNzol试剂说明书的方法提取总RNA；(b)用FastKing一步法除基因组cDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR引物对，其特征在于：/n上游引物：5’-ACTGCCGTTGATACTGCTA-3’；/n下游引物：5’-TCTAATCCTGTTCGCTCCC-3’；/n扩增目的片段为163bp，目的片段序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR引物对，其特征在于：
上游引物：5’-ACTGCCGTTGATACTGCTA-3’；
下游引物：5’-TCTAATCCTGTTCGCTCCC-3’；
扩增目的片段为163bp，目的片段序列如SEQIDNO.3所示。


2.一种荧光定量PCR检测鸭疫里默氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的16SrRNA为检测靶基因，设计特异性引物对；
(2)提取鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的RNA，反转录为cDNA；
(3)以步骤2中的cDNA为模板，以步骤1中的引物对为引物，进行普通PCR扩增目的片段，产物纯化后构建重组质粒，并测序验证；
(4)步骤(3)中测序验证正确的重组质粒进行浓度测定，10倍梯度稀释为不同浓度作标准品，-20℃保存备用；
(5)以步骤(4)中的8个梯度的标准品DNA为模板，SYBRGreen染料法进行荧光定量PCR反应，建立起始模板拷贝数的对数与阈值循环数之间的标准曲线和标准方程；
(6)将待测样品进行RNA提取和反转录为cDNA，然后使用步骤(1)中的引物对对待测样品进行检测，将所测得的阈值循环数根据标准曲线即可计算出待测样品中鸭疫里默氏菌的拷贝数。


3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测鸭疫里默氏菌的方法，其中步骤(1)中，所述引物对序列为：
上游引物：5’-ACTGCCGTTGATACTGCTA-3’；
下游引物：5’-TCTAATCCTGTTCGCTCCC-3’；
扩增目的片段为163bp，目的片段序列如SEQIDNO.3所示。


4.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测鸭疫里默氏菌的方法，其中，步骤(3)中的普通PCR的反应体系为25μL：2×Premix13μL，cDNA模板2μL，ddH2O10μL；
反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃10min。


5.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测鸭疫里默氏菌的方法，其中步骤(3)中重组质粒的构建步骤为：
A.将PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳；
B.跑胶结束，紫外灯...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧芳，陶志云，朱春红，宋卫涛，刘宏祥，徐文娟，章双杰，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32