高镁微环境骨髓干细胞微球载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供高镁微环境骨髓干细胞微球载体及其制备方法和应用，将镁离子复合入微球载体中形成局部高镁环境，所述微球载体尺寸在500μm以内，所述镁离子浓度为2.5mM‑10mM。本发明专利技术提出了构建局部高镁微环境干细胞微球载体的概念和制备方法，一方面，筛选出镁离子浓度在2.5mM‑5mM时，成骨诱导作用最佳；其次，制备的干细胞微球载体直径在500μm以内，有效提高了干细胞的负载率和存活率，同时利用局部高镁环境促负载的干细胞成骨向分化，降低使用蛋白因子带来的成本昂贵、缓释难控等弊端；最后，制备的高镁微环境干细胞微球载体用于骨缺损再生修复时，缺损区新生骨明显增多，修复效果显著提升。

Microsphere carrier of bone marrow stem cells in high magnesium microenvironment and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
高镁微环境骨髓干细胞微球载体及其制备方法和应用
本专利技术属于组织工程与再生医学领域，更具体地讲，涉及一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体及其制备方法和应用。
技术介绍
干细胞具有自我更新能力和多向分化能力，理论上可在体外扩增至足够数量并被诱导分化为特定成体细胞，进而用于组织再生治疗。直接将细胞负载于支架材料上是常用的方法，但由于材料孔径和比表面积的影响，导致移植细胞数量明显受限：多孔支架材料孔径过小会限制细胞渗入支架深部，而孔径扩大，比表面积会随之减小，从而影响细胞的负载数量。微球作为干细胞载体，比之传统支架，具有尺寸小营养易渗透，比表面积大细胞负载量多的优势，同时以微球3D培养干细胞有效地维持了细胞干性，并为干细胞提供稳定的局部环境，有效抵抗受体的免疫排斥等，在组织再生应用中更具优势。镁是人体常量元素，在骨生长发育中不可或缺，镁离子促进成骨的作用已有诸多研究报道。为了进一步提高再生修复效果，拟将具有成骨分化诱导能力的镁离子复合入微球中，构建高镁微环境微球并同时投递干细胞用于骨再生，该方面研究尚未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体。本专利技术的第二个目的在于提供一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体的制备方法。本专利技术的第三个目的在于提供高镁微环境骨髓干细胞微球载体在骨再生中的应用。为实现本专利技术的第一个目的，本专利技术公开以下技术方案：一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体，其特征在于，将镁离子复合入微球载体中形成局部高镁环境，所述微球载体尺寸为100μm-500μm，所述镁离子浓度为2.5mM-10mM。作为一个优选方案，所述镁离子浓度在2.5mM-5mM，此浓度时成骨诱导作用最佳。作为一个优选方案，所述微球载体负载的干细胞密度在5×106-107/ml。为实现本专利技术的第二个目的，本专利技术公开以下技术方案：一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)成骨相关干细胞的获取与培养；(2)将步骤(1)得到的干细胞消化离心后，用高镁培养液重悬，所得细胞悬液与凝胶混合，使用注射器，滴入交联剂中得到载细胞微球，所述载细胞微球直径为100μm-500μm，所述镁离子浓度为2.5mM-10mM。作为一个优选方案，步骤(2)筛选镁离子浓度在2.5mM-5mM，此浓度时成骨诱导作用最佳。作为一个优选方案，步骤(2)使用海藻酸钠凝胶，成胶后海藻酸钠凝胶终浓度在1％—2％。作为一个优选方案，使用的交联剂为CaCl2，SrCl2或者BaCl2中的一种。作为一个优选方案，注射器针头内径在150μm—180μm，使用微量加样器滴加细胞-凝胶混合液，液滴体积在0.4μL以内，针头距交联剂液面1mm以内。为实现本专利技术的第三个目的，本专利技术公开以下技术方案：高镁微环境骨髓干细胞微球载体在骨再生中的应用。水凝胶干细胞微球载体可以注射的方式单独或与传统支架配合修复骨缺损，同时注射的方式可以减小手术创伤，避免创口感染等并发症。本专利技术评估了不同浓度镁离子对骨髓干细胞活性的影响，筛选出适宜细胞存活的镁离子浓度范围；在此基础上检测镁离子对干细胞成骨分化的影响，优化出骨诱导作用最佳的镁离子浓度范围；制备了高镁微环境骨髓干细胞微球载体，评估了干细胞存活率和成骨分化效果，筛选出细胞存活率最佳的微球尺寸及促干细胞成骨向分化的镁离子浓度；制备了高镁微环境骨髓干细胞微球载体，移植于体内观察骨再生效果。研究结果表明：(1)镁离子浓度在20mM内无明显细胞毒性，且具有一定促细胞增殖的作用(2)镁离子浓度在10mM以内时，具有成骨诱导作用；镁离子浓度在2.5mM-5mM时，诱导干细胞成骨向分化效果最佳(3)成功制备直径在1mm以内的载干细胞海藻酸钠微球，且微球直径在500μm时细胞存活率最高；(4)微球局部镁离子浓度在2.5mM-5mM可促进干细胞成骨向分化，且具有促细胞增殖效果(5)高镁微环境干细胞微球明显促进骨缺损修复。本专利技术的优点在于：本专利技术提出了构建局部高镁微环境干细胞微球载体的概念和制备方法，一方面，筛选出浓度在20mM以内的镁离子对细胞无毒性，且具有促进细胞增殖效果，镁离子浓度在2.5mM-10mM时具有成骨诱导作用，镁离子浓度在2.5mM-5mM时成骨诱导效果最佳；其次，制备的干细胞微球载体直径在100μm-500μm，有效提高了干细胞的负载率和存活率，同时利用局部高镁环境促负载的干细胞成骨向分化，降低使用蛋白因子带来的成本昂贵、缓释难控等弊端；最后，制备的高镁微环境干细胞微球载体用于骨缺损再生修复时，缺损区新生骨明显增多，修复效果显著提升。本专利技术不需专门、复杂和昂贵的设备，操作流程简单，有利于推广使用。附图说明图1：不同浓度镁离子对干细胞活性的影响。(a)镁离子半数抑制浓度(IC50)曲线，IC50＝65.91mM；(b)MTT法检测不同浓度镁离子对细胞增殖影响(★★，p<0.01)。图2：不同浓度镁离子对干细胞成骨分化的诱导作用。(a)ALP染色结果；(b)ALP半定量结果(★★，p<0.01)；(c)Weternblot检测干细胞骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)表达情况；(d)干细胞OCN免疫荧光染色结果。图3：不同浓度镁离子诱导干细胞镁离子通道MagT1的表达变化。(a)成骨诱导后干细胞MagT1qPCR结果；(b)成骨诱导后干细胞MagT1、OCN免疫荧光双染；(c)不同浓度镁离子诱导后干细胞MagT1qPCR结果；(d)不同镁离子诱导后干细胞MagT1免疫荧光染色。图4：培养3天后不同尺寸微球内干细胞活死染色结果(绿色表示活细胞，红色表示死亡细胞)。图5：高镁微环境对微球内干细胞活性的影响。(a)培养1天、3天时微球内干细胞活死染色结果；(b)CCK8法检测微球内干细胞存活情况。图6：EdU染色检测高镁微环境微球内干细胞增殖活力。(a)高镁微环境干细胞微球冰冻切片后EdU染色结果(红色为EdU阳性细胞，蓝色为细胞核，粉色为EdU真阳性细胞)；(b)微球干细胞载体内干细胞增殖率(★★，p<0.01)。图7：高镁微环境微球内干细胞成骨分化的qPCR检测结果。(a)培养3天时，微球内干细胞runt相关转录因子2(runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2)表达情况；(b)培养7天时，微球内干细胞OCN表达情况(★★，p<0.01)。图8：为高镁微环境干细胞微球载体修复大鼠颅骨临界骨缺损实验结果，(a)X线及CT三维重建图，(b)CT扫描分析各组BV/TV结果，(c)CT扫描分析各组BMD结果(★★，p<0.01)。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体，其特征在于，将镁离子复合入微球载体中形成局部高镁环境，所述微球载体尺寸为100μm-500μm，所述镁离子浓度为2.5mM-10mM。/n

【技术特征摘要】
1.一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体，其特征在于，将镁离子复合入微球载体中形成局部高镁环境，所述微球载体尺寸为100μm-500μm，所述镁离子浓度为2.5mM-10mM。


2.根据权利要求1所述的一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体，其特征在于，所述镁离子浓度为2.5mM-5mM。


3.根据权利要求1所述的一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体，其特征在于，所述微球载体负载的干细胞密度在5×106-107/ml。


4.一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)成骨相关干细胞的获取与培养；
(2)将步骤(1)得到的干细胞消化离心后，用高镁培养液重悬，所得细胞悬液与凝胶混合，使用注射器，滴入交联剂中得到载细胞微球，所述载细胞微球直径为100μm-500μm，所述镁离子浓度为2.5mM-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋欣泉，张文杰，林思涵，杨光正，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31