一种检测生物样本中的蛋白质复合体的方法技术

本发明专利技术提供一种检测生物样本中的蛋白质复合体的方法，包括共价交联、变性处理、溶液置换、免疫共沉淀和质谱分析步骤。本发明专利技术通过变性处理步骤破坏蛋白三维结构而使肽链散开，以减少肽链的空间位阻效应，可以使蛋白质复合体更好地被特异性抗体识别。而且，由于变性处理，埋藏于肽链疏水中心的抗原决定簇暴露出来作为线性表位，可以采用针对线性表位的抗体进行免疫共沉淀，为免疫共沉淀提供了新颖的思路。本发明专利技术的检测方法有利于开展蛋白质复合体和蛋白质相互作用的研究。

A method for detecting protein complexes in biological samples

【技术实现步骤摘要】
一种检测生物样本中的蛋白质复合体的方法
本专利技术属于生化分析
，尤其属于蛋白质分析
，具体涉及一种检测生物样本中的蛋白质复合体的方法，该方法可以研究蛋白质相互作用。
技术介绍
生物体内存在众多的蛋白质(包括酶类)，各种蛋白质以及蛋白质之间的相互作用，对于维持生物体的正常生理功能都起到重要的作用。蛋白质相互作用是指两个或两个以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体的过程。蛋白质相互作用涉及几乎所有的生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等。而且，许多具有重要功能的蛋白质分子常以二聚体、三聚体或寡聚体的形式发挥作用，这些蛋白间的相互作用对其生理功能的实现十分重要。研究蛋白相互作用，不仅可以从分子水平上揭示蛋白质的功能，而且对于研究生物体的生长、发育、分化和凋亡等生命活动规律至关重要，为探讨重大疾病的机理、疾病治疗、疾病预防和新药开发提供重要的理论基础。研究蛋白质结构与相互作用的传统技术包括核磁共振技术、X射线晶体衍射技术等，对于蛋白质的纯度、结晶性和绝对量均有比较高的要求，限制了其广泛应用。化学交联结合质谱技术，简称交联质谱技术(英文缩写CXMS或XL-MS)，是近年来发展起来的一种获取蛋白质结构信息的新方法。它利用化学交联剂处理蛋白质样品，将空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来，然后利用基于高精度质谱的蛋白质组学手段分析交联产物。以小分子交联剂DSSO为例，参见图1，蛋白质1和蛋白质2在交联剂DSSO作用下发生交联反应，然后利用自下而上的蛋白质组学流程，将交联蛋白质酶解成肽段后进行质谱分析，因DSSO小分子设计有质谱裂解位点，可以得到交联肽段质谱图，进而解析出交联的蛋白质。交联质谱技术的交联反应发生在溶液态，反映了蛋白质的溶液构象。交联质谱技术可以获取蛋白质的结构信息，表征蛋白质动态，在蛋白质复合体的蛋白相互作用研究中发挥作用。免疫共沉淀技术(co-IP)可将目标蛋白质复合体从复杂样本中纯化出来，是一种常用的蛋白相互作用研究手段。目标蛋白质复合体包含目标蛋白及与目标蛋白结合的结合蛋白。图2显示了免疫共沉淀技术的流程，首先采用抗目标蛋白的特异性抗体与蛋白样本进行孵育，通过免疫亲和使得特异性抗体与目标蛋白结合在一起，从而与目标蛋白质复合体结合在一起，进一步采用蛋白A或蛋白G包被的磁珠，可特异性地结合抗体的Fc区域，经过清洗和洗脱后获得目标蛋白质复合体。目前在蛋白相互作用研究以及结构蛋白质组学研究中，日益将交联质谱技术与免疫共沉淀技术相结合，先采取化学交联反应将蛋白质复合体稳定，进而使用免疫共沉淀通过捕获蛋白质复合体中的目的蛋白来捕获蛋白质复合体，然后进行质谱分析(参见例如Cross-linkingProteomicsIndicatesEffectsofSimvastatinontheTLR2InteractomeandRevealsACTR1AasaNovelRegulatoroftheTLR2SignalCascade.MolCellProteomics.2019Sep；18(9):1732-1744)。但是，这种方法忽略了这样一种可能，即蛋白质复合体的肽链通过交联反应共价连接在一起，会形成空间位阻效应，可能会阻碍特异性抗体与目标蛋白的免疫亲和反应，使得特异性抗体无法捕获到蛋白质复合体。另外，可用于免疫共沉淀的抗体是抗天然蛋白的抗体，通常制备较困难且生产周期长，而且商品化的此类抗体也较缺乏，不方便研究工作的开展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术中将交联质谱技术与免疫共沉淀技术相结合时，使用化学交联剂稳定蛋白质复合体之后出现的空间位阻问题以及用于免疫共沉淀的抗体缺乏的问题，有利于开展蛋白质复合体和蛋白质相互作用的研究。本专利技术通过下述技术方案来实现上述目的：一种检测生物样本中的蛋白质复合体的方法，其中该蛋白质复合体包含目标蛋白和与该目标蛋白相互作用的结合蛋白，该方法包括以下步骤：共价交联：用化学交联剂使该蛋白质复合体在非蛋白质变性条件下发生共价交联反应，以使该蛋白质复合体稳定化；变性处理：将该蛋白质复合体进行蛋白变性处理，以破坏维持蛋白三维结构的弱相互作用力；溶液置换：使经变性处理的蛋白质复合体处于适合进行免疫共沉淀的溶液体系中；免疫共沉淀：用针对该目标蛋白的特异性抗体与经过溶液置换处理的该蛋白质复合体进行免疫共沉淀，以捕获该蛋白质复合体，并通过捕获该特异性抗体使该蛋白质复合体与该生物样本分离，并将该特异性抗体从该蛋白质复合体洗脱，得到纯化的该蛋白质复合体；质谱分析：将纯化的该蛋白质复合体进行酶解形成肽段，然后进行质谱分析。进一步地，该蛋白质复合体位于细胞内，该共价交联反应在该细胞内原位进行；或者，该蛋白质复合体在细胞提取液中，该共价交联反应在该细胞提取液中进行。更进一步地，该化学交联剂为二琥珀酰亚胺亚砜(DSSO,disuccinimidylsulfoxide)或者二琥珀酰亚胺二丁酸(DSBU,disuccinimidyldibutyricacid)。进一步地，该变性处理采用化学变性方法或者物理变性方法。更进一步地，该化学变性方法采用尿素沉淀方法如8M尿素沉淀方法、丙酮沉淀方法或者改变缓冲液中的渗透质的方法。进一步地，该物理变性方法采用加热变性方法。进一步地，在该免疫共沉淀步骤中，该特异性抗体为针对天然形式的该目标蛋白的抗体，或者为针对该目标蛋白中的线性表位的抗体。进一步地，在该溶液置换步骤中，该适合进行免疫共沉淀的溶液体系为非变性蛋白裂解液。进一步地，该适合进行免疫共沉淀的溶液体系为非变性蛋白裂解液。进一步地，该分离纯化步骤使用蛋白A包被的磁珠或蛋白G包被的磁珠来进行。本专利技术首先通过化学交联剂使蛋白质复合体发生共价交联反应以稳定蛋白质复合体，然后通过对蛋白质复合体进行变性处理，破坏维持蛋白三维结构的弱相互作用力，破坏蛋白三维结构而使肽链散开，以减少肽链的空间位阻效应。一些可能因为蛋白相互作用而埋藏于肽链疏水中心的抗原决定簇将重新暴露在溶液中，使得抗体抗原反应可以发生，解决了因交联反应引起的空间位阻效应造成蛋白质复合体不能被特异性抗体识别的问题。这样，与未经变性处理相比，变性处理可以使特异性抗体捕获到更多的蛋白质复合体，使得交联质谱与免疫共沉淀技术的联用更为有效。同时，由于经过变性处理，埋藏于肽链疏水中心的抗原决定簇暴露出来，因此不仅可以采用针对天然形式的目标蛋白的抗体进行免疫共沉淀，而且可以采用针对该目标蛋白中的线性表位的抗体进行免疫共沉淀，为免疫共沉淀提供了新颖的思路。抗线性表位抗体易于生产且有大量商业化抗体产品，丰富了特异性抗体的来源，方便了蛋白质实验研究的开展。附图说明图1是以小分子交联剂二琥珀酰亚胺亚砜(DSSO)为例说明交联质谱技术流程的示意图；图2是显示免疫共沉淀和蛋白质复合体洗脱技术流程的示意图；图3是显示本专利技术的检测方法中，变性处理使得抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测生物样本中的蛋白质复合体的方法，所述蛋白质复合体包含目标蛋白和与所述目标蛋白相互作用的结合蛋白，所述方法包括以下步骤：/n共价交联：用化学交联剂使所述蛋白质复合体在非蛋白质变性条件下发生共价交联反应，以使所述蛋白质复合体稳定化；/n变性处理：将所述蛋白质复合体进行蛋白变性处理，以破坏维持蛋白三维结构的弱相互作用力；/n溶液置换：使经变性处理的蛋白质复合体处于适合进行免疫共沉淀的溶液体系中；/n免疫共沉淀：使针对所述目标蛋白的特异性抗体与经过溶液置换处理的所述蛋白质复合体进行免疫共沉淀，以捕获所述蛋白质复合体，并通过捕获所述特异性抗体使所述蛋白质复合体与所述生物样本分离，并将所述特异性抗体从所述蛋白质复合体洗脱，得到纯化的所述蛋白质复合体；/n质谱分析：将纯化的所述蛋白质复合体进行酶解形成肽段，然后进行质谱分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测生物样本中的蛋白质复合体的方法，所述蛋白质复合体包含目标蛋白和与所述目标蛋白相互作用的结合蛋白，所述方法包括以下步骤：
共价交联：用化学交联剂使所述蛋白质复合体在非蛋白质变性条件下发生共价交联反应，以使所述蛋白质复合体稳定化；
变性处理：将所述蛋白质复合体进行蛋白变性处理，以破坏维持蛋白三维结构的弱相互作用力；
溶液置换：使经变性处理的蛋白质复合体处于适合进行免疫共沉淀的溶液体系中；
免疫共沉淀：使针对所述目标蛋白的特异性抗体与经过溶液置换处理的所述蛋白质复合体进行免疫共沉淀，以捕获所述蛋白质复合体，并通过捕获所述特异性抗体使所述蛋白质复合体与所述生物样本分离，并将所述特异性抗体从所述蛋白质复合体洗脱，得到纯化的所述蛋白质复合体；
质谱分析：将纯化的所述蛋白质复合体进行酶解形成肽段，然后进行质谱分析。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白质复合体位于细胞内，所述共价交联反应在所述细胞内原位进行；或者，所述蛋白质复合体在细胞提取液中，所述共价交联反应在所述细胞提取液中进行。


3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张可人，任艳，张宇星，林志龙，陈秋实，李思奇，潘火珍，王欣然，张元良，
申请(专利权)人：深圳华大临床检验中心，
类型：发明
国别省市：广东;44