一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物枯萎病防治技术领域，公开了一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB11，为不动杆菌(Acinetobacter sp.)，菌种保藏号为CGMCC No.17804。所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB11 16S rRNA基因序列为SEQ ID No.1。从河南省桐柏山自然保护区土壤样品中分离、纯化，并采用对峙培养法筛选获得1株对苦瓜枯萎病具有良好生防效果的生防细菌，通过形态观察、生理生化特性分析及16S rRNA基因序列分析对其进行分类鉴定，并进行离体叶片、盆栽试验和田间试验的生防效果测定，田间防治效果70％以上，为其进一步的开发利用提供理论依据。

A Biocontrol Strain against Fusarium Wilt of balsam pear and its application

【技术实现步骤摘要】
一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用
本专利技术属于植物枯萎病防治
，尤其涉及一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用。
技术介绍
苦瓜是重要的保健蔬菜之一，在我国广泛种植，具有较高的经济效益。近年来，随着苦瓜种植面积的不断增大，重茬连作现象也十分普遍，苦瓜枯萎病害发生和危害日趋严重，一般病株率10％～20％，严重时高达80％以上，造成大量减产甚至绝收。目前，苦瓜枯萎病在我国各苦瓜种植区均有发生，特别是在连作土壤，由于病原菌大量积累，且缺乏有效的防控措施，给苦瓜生产带来巨大的损失，因此，苦瓜枯萎病已成为制约苦瓜产业发展的主要因素。苦瓜枯萎病的防治措施主要依赖抗病品种的选育与利用和化学防治。抗病品种选育和利用是农作物枯萎病防治最经济有效的防治措施，但由于抗病品种选育周期长，且苦瓜枯萎病为典型的土传病害，生产上至今尚无实用的抗病品种大面积推广；化学防治是目前生产上最常用的防治手段，但是由于化学防治容易产生环境污染、“3R”和“3致”等生产和食品安全问题，因此其应用在苦瓜枯萎病综合防控上受到一定的限制。生物防治因其环境兼容性良好、防治效果持久，且能跟土壤处理等农业防治措施配合使用，已成为枯萎病防治综合治理的基础和有效途径。综上所述，现有技术存在的问题是：目前生产上防治苦瓜枯萎病的化学农药不合理和过量使用造成的农药残留、环境污染等生产和食品安全问题尤为严重。解决上述技术问题的意义：通过平板对峙、盆栽和小区试验等方法鉴定了一株对苦瓜枯萎病具有稳定高效生防效果的生防菌株CYB11。该菌株在有效防治苦瓜枯萎病的同时，可以促进苦瓜生长、提高苦瓜的抗病能力，是一种具有重要应用潜力的生防菌株，为苦瓜枯萎病的绿色防控提供了新的生防资源和防控途径。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用。本专利技术是这样实现的，一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB11，为不动杆菌(Acinetobactersp.)，菌种保藏号为CGMCCNo.17804。进一步，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB1116SrRNA基因序列为SEQIDNO.1。本专利技术的另一目的在于提供一种所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法包括以下步骤：第一步，在直径为9cm的PDA平板中央接入1块直径为5mm的苦瓜枯萎病菌(SD-1)菌饼；第二步，同时用接种环蘸取细菌在平板边缘2cm处对称划线，在28℃培养箱中倒置培养7d，重复3次。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株防治苦瓜枯萎病的使用方法。本专利技术的另一目的在于提供一种所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的及离体叶片检测方法。所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的检测方法生防菌对离体苦瓜叶片的生防效果测定：取托盘若干，84消毒液处理之后，用湿润的灭菌吸水纸铺满托盘底部。选取健康的苦瓜叶片从叶柄处剪断，70％的酒精消毒处理之后，无菌水冲洗3遍，摆放于托盘中；取发酵48h后的细菌发酵液在叶柄处用移液枪滴加200μL；取培养5d的苦瓜枯萎病菌(SD-1)用直径为5mm的打孔器打孔若干，放置于苦瓜叶柄处，叶柄处菌块上覆盖吸水纸用于固定菌块，用保鲜膜覆盖托盘，每处理5个重复。种子催芽处理：选用颗粒饱满的苦瓜种子，在55℃恒温水浴锅中浸泡15min后，放入清水中浸泡12h，而后移入用滤纸保湿的培养皿中，置于28℃恒温培养箱催芽培养48h，每天定时更换润湿的滤纸以保证种子萌发所需要的水分；苦瓜种子露白后，播种于盆栽小盆中，放置在光照培养箱培养，待幼苗长出4片真叶时备用。进一步，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的检测方法病原菌孢子悬浮液的制备：将3块5mm直径的苦瓜枯萎病菌(SD-1)菌饼接入装有150mLPDB的250mL锥形瓶中，28℃恒温150r/min振荡培养7d，过滤后得到孢子悬浮液，用血球计数板计数，配制成孢子浓度为108个/mL的菌悬液；生防菌菌悬液的制备：将培养3d的生防菌单菌落接入到装有150mLLB液体培养基的250mL锥形瓶中，28℃恒温150r/min振荡培养2d，得到细菌菌悬液；进一步，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的检测方法以苦瓜枯萎病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌和小麦全蚀病菌为靶标菌，将CYB11生防菌株进行抗菌谱测定；验证生防菌对苦瓜枯萎病的生防效果，取苦瓜幼苗的第2和第3片真叶进行离体接种生防效果测定；选取生长状况良好且一致的长出4片真叶的苦瓜幼苗分为5组，每组4株，空白对照组，不作处理；生防菌处理组:吸取10mL生防菌菌悬液处理活体苦瓜盆栽，24h后用10mL病原菌(SD-1)孢子悬浮液SD-1作同样处理；结果显示在发病前期、中期和后期，生防菌株CYB11对苦瓜枯萎病有良好的生防效果。综上所述，本专利技术的优点及效果为：本专利技术利用LB培养基对采集自河南省桐柏山自然保护区的15份土壤样品中的细菌进行了分离纯化，以苦瓜枯萎病菌为靶标，通过平板对峙培养法筛选对其有拮抗活性的生防菌株，并以玉米大斑病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌和小麦全蚀病菌等植物病原菌进行抗菌谱测定，通过形态学、生理生化测定和16SrRNA基因序列分析对生防菌株进行了分类鉴定。本专利技术对菌株防治苦瓜枯萎病生防效果的离体叶片检测为界内首创。结果表明，生防菌株CYB11对苦瓜枯萎病菌有稳定的拮抗活性；生理生化指标的测定结果表明，CYB11菌株不能分解纤维素，有较好的耐盐性(3％)，不能氧化葡萄糖，可还原硝酸盐，不还原亚硝酸，不能液化明胶，不能分解淀粉，可利用蔗糖、麦芽糖和山梨醇；分类鉴定结果表明，生防菌株CYB11为不动杆菌(Acinetobactersp.)。对该菌株进行离体叶片、盆栽试验和田间试验的生防效果测定，离体叶片生防效果明显，盆栽试验促生防病效果显著，田间防治效果达70％以上，为其进一步的开发利用提供有效的理论依据。附图说明图1是本专利技术实施例提供的防治苦瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的生防菌CYB11的菌落形态图。图3是本专利技术实施例提供的生防菌株CYB11对病原菌抑菌谱的测定结果示意图。图4是本专利技术实施例提供的生防菌株CYB11对离体苦瓜叶片的生防效果测定结果示意图。图5是本专利技术实施例提供的防菌株CYB11对盆栽苦瓜的促生防病效果测定结果示意图；图中：(a)接SD-1后20d苦瓜生长情况；(b)接SD-1后22d苦瓜生长情况；(c)接SD-1后25d苦瓜生长情况。图6是本专利技术实施例提供的生防菌株CYB11处理后苦瓜株高的测定结果示意图。图7是本专利技术实施例提供的生防菌株CYB11基于16SrRNA基因序列构建的Neighbour-Joining系统进化树示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株，其特征在于，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB11，为不动杆菌(Acinetobacter sp.)，菌种保藏号为CGMCC No.17804。/n

【技术特征摘要】
1.一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株，其特征在于，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB11，为不动杆菌(Acinetobactersp.)，菌种保藏号为CGMCCNo.17804。


2.如权利要求1所述的防治苦瓜枯萎病的生防菌株，其特征在于，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB1116SrRNA基因序列为SEQIDNo.1。


3.一种如权利要求1所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法，其特征在于，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法包括以下步骤：
第一步，在直径为9cm的PDA平板中央接入1块直径为5mm的苦瓜枯萎病菌菌饼；
第二步，同时用接种环蘸取细菌在平板边缘2cm处对称划线，在28℃培养箱中倒置培养7d，重复3次。


4.一种如权利要求1所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的基因序列分析方法，其特征在于，所述基因序列分析方法采用CTAB法提取分离的细菌基因组DNA并对其PCR扩增，25μL反应体系：2×PCRmix12.5μL、引物27F1μL、引物1492R1μL、DNA模板1μL、无菌水9.5μL；PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测；将阳性结果的PCR产物交由生物工程公司进行测序；将分离菌株的16SrRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对，确定与之亲缘关系最近的种属；从数据库获得相关种属的16SrRNA基因序列，用MEGA7软件构建系统发育树，采用邻接法进行聚类分析并构建系统进化树。


5.一种利用权利要求1～2任意一项所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株制造的菌剂。


6.一种如权利要求1所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的检测方法，其特征在于，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的检测方法利用LB培养基对采集自河南省桐柏山自然保护区的15份土壤样品中的细菌进行了分离纯化，以苦瓜枯萎病菌为靶标，通过平板对峙培养法筛选对其苦瓜枯萎病菌有拮抗活性的菌株，并以玉米大斑病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌和小麦全蚀病菌等病原菌进行抗菌谱测定。


7.如权利要求6所述的防治苦瓜枯萎病的生防菌株的分离和筛选方法，
土壤中细菌的分离：分别取采自河南省桐柏山自然保护区的15份土壤样品于自然条件下风干，取风干后的土壤各10g置于研钵中，研磨成粉末后加入装有90mL灭菌无菌水的250mL锥形瓶中，放置在摇床上150r/min震荡30min，取出静置待土壤颗粒沉淀；取溶液上清1mL加入装有9mL无菌水的试管中，梯度稀释后，选取10-3和10-4稀释度的溶液涂布于LB培养皿中，每个皿接种200μL，每个梯度3个重复，将培养皿于28℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：文才艺，赵莹，赵玉华，王留超，董文盼，祁魏峥，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41