快速检测浙麦冬中两种真菌的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测浙麦冬中两种真菌的引物组、试剂盒及方法，针对病原菌在浙麦冬不同的发育时期和环境条件下所表现的症状可能一样的问题以及现有检测方法耗时久的问题。本发明专利技术利用巢氏多重PCR建立了一种对浙麦冬上两种主要病原菌的多目标快速检测的引物组和方法，整个检测流程速度快，方法的检出限可以达到100pg/μL。并在实际应用中发现与传统平板分离法相比，该体系能更快、更准确地检测病原体，且检出率几乎可达90％以上。

Primer set, kit and method for rapid detection of two fungi in Ophiopogon japonicus

【技术实现步骤摘要】
快速检测浙麦冬中两种真菌的引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及微生物
，特别是涉及一种快速检测浙麦冬中两种真菌的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
麦冬(Ophiopogonjaponicas)为百合科植物麦冬的干燥块根。麦冬性甘、微苦、凉，有滋阴生津、润肺止咳、清心除烦之功效。始载于神农本草经，为常用滋补中药之一，同时也是我国药典所列药食同源品类之一。麦冬具有很高的药用和养生保健价值。近年来，对麦冬的有效成分及其药理作用和机制进行了广泛深入的研究，主要有效成分为多糖、皂苷和黄酮类，药理作用主要集中在降血糖、抗衰老、抗氧化及改善心脑血管疾病等方面。麦冬主要栽培于浙江和四川两省，浙麦冬在浙江以栽后第四年收获的麦冬作为药材，在四川麦冬以栽后第二年收获作为药材，传统上认为质量以浙麦冬为最佳。浙麦冬是著名的“浙八味”之一，具有形状短壮饱满，色泽黄亮、滋粘糯性、味甘气清香、优质地道等优点。目前浙江省浙麦冬种植面积达四千多亩，而针对于麦冬药品的研究开发也越来越多，各种剂型层出不穷，例如参麦注射液、生脉胶囊等麦冬衍生产品在2015年销售额达就达20多亿元。因此随着市场的扩大，浙麦冬的种植规模也在不断的增加，但由于种植技术的不规范加上农药的乱用滥用，使得植株抗病性减弱、病原累积严重再加上农药的滥用乱用，严重影响了浙麦冬的产量与质量。因此，及早诊断，及早防治浙麦冬病害是提高浙麦冬产量与质量至关重要一环。经田间调查发现炭疽病和黑斑是浙麦冬病害中两种发生频率最高的真菌病害，引起这两种病害的病原菌分别是山麦冬炭疽菌Colletotorichumliriopes和互隔交链孢菌Alternariaalternata。这些病原菌长期存活于土壤，遇到适宜的气候条件时，便会造成病害的大量爆发。此外这些病害常常混合发生，存在多种病原菌复合侵染的现象，且不同的病原菌在浙麦冬不同的发育时期，不同的环境条件下所表现的症状可能一样，仅靠人为的肉眼鉴定存在一定的困难与误差。因此，建立快速检测技术对浙麦冬病害的防治具有重要的指导意义。随着分子生物学的发展，免疫技术和PCR技术不断引入该领域，但植物病害的病原体种类繁多，血清类型多，漏检问题难以避免，而且血清反应的特异性较差，从而使得免疫技术在大范围的实际应用中受到制约。PCR及其相关衍生技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的检测研究。巢氏PCR即两步PCR，它使用了两对PCR引物进行扩增：一对普通引物一对巢式引物，以第一轮普通引物扩增出的产物作为第二轮PCR的模板，巢式引物也是根据第一轮普通引物扩增出的片段所设计的特异性引物，因此巢氏PCR显著的提高了反应的灵敏度及特异性。多重PCR是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物，当体系中存在与各引物对特异互补的模板时，就会出现相应的条带。因此当巢氏PCR与多重PCR结合应用于植物病原菌的快速检测时，不仅可以提高检测的灵敏度还可以实现多种病原菌的多目标快速检测。传统的植物病害的诊断大多依靠平板分离法，先分离出病原真菌，再对病原真菌进行鉴定，这不仅需要先进的分类学知识，而且需要时间和成本，整个过程可能需要15～20天。但在疾病的早期发现和诊断对于农民预防疾病暴发和选择准确的控制策略至关重要。因此，有必要建立一种准确、快速、经济的检测方法，用于田间植物病原菌的早期诊断。利用巢氏多重PCR所建立的浙麦冬上两种病原真菌的快速检测体系整个流程只需要5～6个小时，并且具有高特异性、高灵敏度等优点。
技术实现思路
本专利技术利用巢氏多重PCR建立了一种对浙麦冬上两种主要病原菌的多目标快速检测体系，并对该体系进行了优化，使的该体系的检出限可以达到100pg/μL。并在实际应用中发现与传统平板分离法相比，该体系能更快、更准确地检测病原体，且检出率几乎可达90％。本专利技术的目的是为浙麦冬主要真菌病害的早期诊断提供一项新技术。本专利技术的另一目的是提供该快速检测方法在浙麦冬病害早期诊断上的应用，从而早期防治浙麦冬病害，减少浙麦冬产量损失，保证浙麦冬的高品质。本专利技术两种病原真菌特异性引物的设计与筛选：为了同时、准确的检测两种病原真菌，引物必须是特异性的，且扩增出的片段大小也应不同，这样才可以通过凝胶电泳将各个条带分离开，再根据每个病原菌所对应条带的有无以及亮度来实现对病原真菌的定性及半定量。根据NCBI数据库中山麦冬炭疽菌C.liriopes和互隔交链孢菌A.alternata两种病原真菌的核糖体内转录间隔区(ITS)序列设计他们的种特异性引物。本专利技术中设计出的山麦冬炭疽菌C.liriopes特异性引物对一：正向引物MTJ8-F：ATACCCTTTGTGACATACCT(SEQIDNO.1所示)；反向引物MTJ8-R：CGAATCCCAATGCGAGAC(SEQIDNO.2所示)；目的片段大小为433bp；互隔交链孢菌A.alternata特异性引物对二：正向引物Al-F：GTCTTTTGCGTACTTCTTGTTT(SEQIDNO.3所示)；反向引物Al-R：GAACAGGCATGCCCTTTGGA(SEQIDNO.4所示)；目的片段大小为249bp；两对特异性引物均通过了特异性及灵敏度检测：特异性检测结果表明，两对特异性引物均只能在其对应的病原真菌中扩增出单一明亮的条带，而在其他病原真菌及健康浙麦冬中没有条带；灵敏度检测结果表明，引物MTJ8-F/MTJ8-R灵敏度可达100pg/μL、Al-F/Al-R的灵敏度可达10fg/μL。两者混合形成的两重巢氏多重PCR灵敏度也可达100pg/μL。本专利技术公开了一种快速检测浙麦冬中两种主要病原真菌的试剂盒，包括所述的引物组(SEQIDNO.1～4所示)。进一步的，所述试剂盒中引物浓度均为10μM/L，包含MTJ8-F/MTJ8-R1.6μL、Al-F/Al-R1.6μL。进一步的，所述的试剂盒还包括真菌通用引物对，其序列如下：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG(SEQIDNO.5所示)；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQIDNO.6所示)。多重巢氏PCR对浙麦冬中两种主要病原菌的检测方法，按以下步骤进行：(1)带病植株DNA的提取：取2g带病植物组织，于液氮中冷冻后打碎成粉末，使用适合多糖多酚植物DNA的提取方法提取其DNA，本专利技术采用了改良的CTAB法提取，具体操作如下：在打成粉末的植物组织中加入500μL的CTAB溶液，于液氮内冷冻2min，再放于75℃水浴锅内融化2min，重复3次，最后1次于75℃水浴锅内融化30min，接着加入500μL的DNA提取液(25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇)，上下颠倒混匀，12000r/min离心10min，取上清液400μL，再重复上述步骤一次后加入800μL冰无水乙醇及5M的氯化钠溶液200μL沉淀1h，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗涤两次，自然风干后用50μLddH2O溶解DNA，-20℃保存备用。提取的DNA用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测浙麦冬中两种真菌的引物组，其特征在于所述的两种真菌为山麦冬炭疽菌Colletotorichum liriopes和互隔交链孢菌Alternaria alternata；的引物组包括四对特异性引物对，每对特异性引物对的具体引物序列如下：/n特异性引物对一：/n正向引物MTJ8-F：ATACCCTTTGTGACATACCT；/n反向引物MTJ8-R：CGAATCCCAATGCGAGAC；/n特异性引物对二：/n正向引物Al-F：GTCTTTTGCGTACTTCTTGTTT；/n反向引物Al-R：GAACAGGCATGCCCTTTGGA。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测浙麦冬中两种真菌的引物组，其特征在于所述的两种真菌为山麦冬炭疽菌Colletotorichumliriopes和互隔交链孢菌Alternariaalternata；的引物组包括四对特异性引物对，每对特异性引物对的具体引物序列如下：
特异性引物对一：
正向引物MTJ8-F：ATACCCTTTGTGACATACCT；
反向引物MTJ8-R：CGAATCCCAATGCGAGAC；
特异性引物对二：
正向引物Al-F：GTCTTTTGCGTACTTCTTGTTT；
反向引物Al-R：GAACAGGCATGCCCTTTGGA。


2.一种快速检测浙麦冬中两种真菌的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物组。


3.如权利要求2所述的快速检测浙麦冬中两种真菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中引物浓度均为10μM/L，包含MTJ8-F/MTJ8-R1.6μL、Al-F/Al-R1.6μL。


4.如权利要求2所述的快速检测浙麦冬中两种真菌的试剂盒，其特征在于还包括真菌通用引物对，其序列如下：
ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；
ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。


5.一种快速检测浙麦冬中两种真菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)带病植株DNA的提取：
带病植物组织，于液氮中冷冻后打碎成粉末，提取其DNA；
2)巢氏多重PCR的扩增：
第一轮PCR使用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增带病植株中病原真菌的ITS序列，其中ITS1序列如SEQIDNo.5所示，ITS4序列如SEQIDNo.6所示；
第二轮PCR使用第一轮PCR的产物作为模板，采用权利要求1中的引物组作为引物；
3)扩增结果的检测：
根据步骤2)扩增出的条带片段大小判断其对应的病原真菌；其中山麦冬炭疽菌C.liriopes目的片段大小为433bp；互隔交链孢菌A.alterna...

【专利技术属性】
技术研发人员：申屠旭萍，曹瑱艳，宋阳，俞晓平，许益鹏，刘光富，张蓬军，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33