CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法技术

本申请属于分子生物学技术技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法。该方法适用于烟草基因编辑突变体筛选鉴定，具体包括：获得CRISPR/Cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组DNA、利用高通量测序筛选鉴定基因编辑阳性突变体等步骤。本申请筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体过程中，配合高通量测序技术应用，可以部分克服现有鉴定过程繁琐的缺陷，而且具有可以批量应用的优点，尤其是相较于现有常规的Sanger测序，本申请的高通量测序可以大幅降低测序成本，表现出较好的实用价值。

Screening and identification of CRISPR / cas9 gene editing mutants

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法
本申请属于分子生物学技术
，具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法。
技术介绍
CRISPR（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）是生物进化历程中病毒和细菌之间进行斗争而产生的免疫武器，简而言之就是病毒能够把自身的基因整合进入细菌体内，利用细菌为自己的基因进行复制，而细菌为了清除外来入侵的病毒基因，进化出细菌特有的免疫系统——CRISPR系统，细菌可以利用该系统把病毒基因从自身的染色体上切除。基于此原理，目前科学家们开发了一种针对Cas9蛋白操作的技术，可以对多种靶细胞的DNA进行切除，该技术被称之为CRISPR/Cas9基因编辑系统，已成为生命科学领域最热门的技术之一。现有CRISPR/Cas9基因编辑系统在动植物中的研究应用已经非常成熟，利用该技术能够在全基因组水平进行基因编辑和功能筛选。而基因编辑完成后即需基因编辑后突变体进行筛选鉴定。现有筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，该方法适用于烟草基因编辑突变体筛选鉴定，具体包括如下步骤：/n（一）获得CRISPR/Cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组DNA/n具体CRISPR/Cas9基因编辑突变体获得过程为：/n首先构建目标基因的CRISPR/Cas9载体，然后利用电转法将阳性载体转入农杆菌，利用农杆菌介导侵染烟草叶盘，通过共培养以及筛选培养获得愈伤组织及阳性小芽，然后将其移栽至基质中，继续培养至开花结果，此即为CRISPR/Cas9基因编辑突变体；最后采集适量CRISPR/Cas9基因编辑突变体烟株叶片作为样品，提取其基因组DNA备用；/...

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，该方法适用于烟草基因编辑突变体筛选鉴定，具体包括如下步骤：
（一）获得CRISPR/Cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组DNA
具体CRISPR/Cas9基因编辑突变体获得过程为：
首先构建目标基因的CRISPR/Cas9载体，然后利用电转法将阳性载体转入农杆菌，利用农杆菌介导侵染烟草叶盘，通过共培养以及筛选培养获得愈伤组织及阳性小芽，然后将其移栽至基质中，继续培养至开花结果，此即为CRISPR/Cas9基因编辑突变体；最后采集适量CRISPR/Cas9基因编辑突变体烟株叶片作为样品，提取其基因组DNA备用；
（二）利用高通量测序筛选鉴定基因编辑阳性突变体
利用高通量测序方法对步骤（1）中获得的CRISPR/Cas9基因编辑突变体进行筛选鉴定，具体而言：
（1）针对靶位点设计PCR引物
靶位点设计好之后，在靶位点上下游设计特异性检测引物；
（2）对目的片段进行首轮PCR扩增
以提取的烟草基因组DNA为模板，利用步骤（1）中针对靶位点所设计的PCR引物进行扩增；
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收特异性目的条带；
（3）第二轮PCR
高通量测序前，给每个样本的序列中加入一段代表样本来源的Barcode序列标签；
（4）高通量测序
步骤（3）中第二轮PCR反应结束后，把孔板上不同排的样品先混合到其中一排，再将这一排的样品混合在一起，Control孔单独处理；
琼脂糖凝胶电泳检测混合后的PCR产物，胶回收特异性目的条带；
胶回收产物...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏攀，谢小东，王燃，王中，李锋，金立锋，罗朝鹏，武明珠，张剑锋，郑庆霞，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41