鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用。该鸭呼肠孤病毒弱毒Q株是由鸭呼肠孤病毒强毒17117株经Vero细胞连续传代致弱获得，在Vero细胞上增殖水平高，接种1日龄雏鸭无明显临床症状和病理变化，安全性好。用该弱毒Q株制备的活疫苗接种1日龄雏鸭可产生有效免疫保护。

Duck reovirus weak strain and its application

【技术实现步骤摘要】
鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用
本专利技术涉及一株鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
禽呼肠孤病毒(Avianreovirus,ARV)是呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属中的一员，基因组为分节段双链RNA，有10个节段，常见于鸡、火鸡、鸭、鹅及一些鸟类等宿主体内，以病毒性关节炎、肠道病、腱鞘炎、矮小综合征、免疫抑制性疾病及吸收不良综合征等为临床特征。2005年上半年，我国山东、福建、江苏、河北、河南等地饲养的樱桃谷肉鸭，相继发生了一种以脾脏坏死为主要病变的疾病，俗称“脾坏死病”。2011年下半年，在山东、河北、江苏等地樱桃谷肉鸭也发生一种以肝脏不规则坏死或混杂出血斑为特征剖检病变的疾病。2015年以来，山东、江苏、河北等樱桃谷鸭饲养密集区的许多鸭群又发生了以脾脏出血、白色坏死灶或大理石样硬化病变的疾病，病鸭可见肺、心肌、肾、腺胃和肠粘膜等组织出血等病变。种鸭可见跗关节肿大，内有黄色或血样渗出物，严重者关节腔内有干酪样渗出物，患鸭出现不同程度跛行，给养鸭业造成严重经济损失。病原分离鉴定为鸭呼肠孤病毒。该病毒与现已报道流行的鸡源呼肠孤病毒、番鸭源呼肠孤病毒进行遗传进化分析，属于不同分支，为一种新型鸭呼肠孤病毒。免疫接种是防治该病的最有效手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用本专利技术人自行分离、保存的一株鸭呼肠孤病毒强毒株，在Vero细胞上连续传代致弱而筛选出增殖水平高、高度适应Vero细胞、具有良好免疫保护效果的弱毒株，该弱毒株安全性好，可用于作为生产毒株制备鸭呼肠孤病毒病疫苗，有效预防新流行鸭呼肠孤病毒的攻击。经过试验研究发现，该毒株SigmaB蛋白和SigmaC蛋白氨基酸序列与已公开的新型鸭呼肠孤病毒相比有特殊的氨基酸位点差异。本专利技术的技术方案1.一种鸭呼肠孤病毒弱毒株，其特征在于该毒株是由鸭呼肠孤病毒强毒17117株经Vero细胞传代获得，该毒株传代后的SigmaB、SigmaC蛋白氨基酸序列为序列6和序列12，该毒株被命名为鸭呼肠孤病毒(Duckreovirus,DRV)Q株(简称DRVQ株)，该两毒株已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为：CGMCCNo.18889和CGMCCNo.18890。2.本专利技术所述的鸭呼肠孤病毒弱毒株的应用，其特征在于该毒株可用于鸭呼肠孤病毒病活疫苗的制备。3.本专利技术所述的鸭呼肠孤病毒弱毒株的应用，其特征在于所述鸭呼肠孤病毒病活疫苗的制备过程包括使用Vero细胞或BHK细胞或CEF细胞或LMH细胞或DF-1细胞作为疫苗抗原制备用细胞。本专利技术的技术效果本专利技术涉及一株鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用。该毒株是由鸭呼肠孤病毒强毒株经Vero细胞连续传代致弱获得，在Vero细胞上增殖水平高，接种1日龄雏鸭无明显临床症状和病理变化，安全性好。用该弱毒株制备的活疫苗接种1日龄雏鸭可产生有效免疫保护。本专利技术涉及的微生物资源信息本专利技术人2017年由发病樱桃谷种鸭自行分离到并保存的一株鸭呼肠孤病毒强毒株17117株通过在Vero细胞上连续传代致弱而筛选出增殖水平高、高度适应Vero细胞、具有良好免疫保护效果的弱毒株，该株病毒被命名为鸭呼肠孤病毒(Duckreovirus,DRV)Q株(简称DRVQ株)，该两株毒株(鸭呼肠孤病毒强毒17117株和弱毒Q株)已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为为：CGMCCNo.18889和CGMCCNo.18890。具体实施方式1.鸭呼肠孤病毒弱毒株的培育取培养24小时、长成良好单层的Vero细胞，用鸭呼肠孤病毒强毒17117株按照0.5％～1％接种量接种细胞，传代以进行适应性增殖。待细胞病变稳定后，对传代毒进行纯化，纯化毒继续传代至100代、120代，进行安全性评价，试验如下：将100代、120代毒大剂量接种1～3日龄易感鸭，每只肌肉注射0.5ml，并设置生理盐水对照组。自接种之日起，每日观察、记录接种鸭的精神状态、饮食和粪便情况，至第7日，剖检脾脏、肝脏、肾脏、胸腺、法氏囊等病理变化。结果显示，100代、120代毒接种1～3日龄易感鸭后，精神状态、饮食和粪便均正常。剖检脾脏、肝脏、肾脏、胸腺、法氏囊等脏器发育正常，无肉眼可见病变。说明100代毒已经致弱，对雏鸭没有致病性，该株120代毒被命名为鸭呼肠孤病毒弱毒Q株。该两株毒株(鸭呼肠孤病毒强毒17117株和弱毒Q株)已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为为：CGMCCNo.18889和CGMCCNo.18890。2.鸭呼肠孤病毒病活疫苗的制备方法使用鸭呼肠孤病毒弱毒Q株作为疫苗生产用毒种，使用微载体悬浮培养Vero细胞、悬浮培养BHK细胞和转瓶培养的CEF细胞、LMH细胞、DF-1细胞作为抗原制备用材料及方法，将鸭呼肠孤病毒弱毒株接种生长良好的细胞，连续培养观察36～60小时，当细胞病变达80％左右时，收获感染的病毒悬液，加入耐热冻干保护剂，经真空冷冻干燥，制成鸭呼肠孤病毒病活疫苗。3.病毒株特性研究(1)鸭呼肠孤病毒弱毒株的增殖将鸭呼肠孤病毒弱毒株按0.5％～1％接种量接种长成良好单层的Vero细胞或BHK细胞，置37℃、5％CO2培养箱中静置培养，每天观察CPE，36～60小时后，当细胞病变达80％左右时收获，置低温保存。病毒含量≥108.5TCID50/ml。(2)免疫原性取30只1日龄易感雏鸭，随机分为3组，10只/组，第1组肌肉注射鸭呼肠孤病毒弱毒株病毒液，0.2ml/只(含103.0TCID50)，第2、3组不接种作为攻毒对照和空白对照。免疫后7日，第1组和第2组用鸭呼肠孤病毒强毒攻击，肌肉注射，0.5ml/只。攻毒后观察7日，剖检，免疫鸭和空白对照鸭脾脏、肝脏、肾脏、胸腺、法氏囊等脏器发育正常，无肉眼可见病理变化，攻毒对照鸭10/10脾脏病变，表现为肿大、出血、有白色坏死灶或大理石样硬化病变等，部分鸭肝脏和肾脏出血。(3)纯净性按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011)附录进行，鸭呼肠孤病毒弱毒株毒种无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。(4)特异性将鸭呼肠孤病毒弱毒株毒种用MEM液稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗鸭呼肠孤病毒特异性血清混合后，37℃中和90min，接种已长成单层的Vero细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。另设病毒对照和正常细胞对照，各接种6孔，每孔0.5ml。将细胞培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养，连续观察96小时。中和组和正常细胞对照组未出现细胞病变效应(CPE)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭呼肠孤病毒弱毒株，其特征在于该毒株是由鸭呼肠孤病毒强毒17117株经Vero细胞传代获得，该毒株传代后的Sigma B、Sigma C蛋白氨基酸序列为序列6和序列12，该毒株被命名为鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)Q株(简称DRV Q株)，该两毒株已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为：CGMCC No.18889和CGMCCNo.18890。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸭呼肠孤病毒弱毒株，其特征在于该毒株是由鸭呼肠孤病毒强毒17117株经Vero细胞传代获得，该毒株传代后的SigmaB、SigmaC蛋白氨基酸序列为序列6和序列12，该毒株被命名为鸭呼肠孤病毒(Duckreovirus,DRV)Q株(简称DRVQ株)，该两毒株已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保...

【专利技术属性】
技术研发人员：张青婵，郭大伟，孟照洁，彭建云，陈俊霞，贾爱琴，赵妮，徐龙涛，王蕾，张连秀，
申请(专利权)人：齐鲁动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37