紫云英LHY基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供紫云英LHY基因及其应用。紫云英LHY基因及其编码蛋白的序列见SEQ ID NO:1和2。本发明专利技术首次从紫云英中克隆得到LHY基因，并通过农杆菌介导的遗传转化方法，在拟南芥中验证了LHY基因具有调控植物开花的功能，具体为延迟植株开花。转LHY基因的拟南芥株系出现抽薹提前，开花提前，抽薹天数比野生型平均晚18.36天，开花天数比野生型平均晚20.72天。这表明紫云英LHY基因与成花关系密切，其具有调节开花时间的功能。将该基因应用于植物性状改良，具有良好的应用前景。本发明专利技术提供的LHY基因及其编码蛋白为培育植物新品种提供了宝贵资源。

The LHY gene of ziyunying and its application

【技术实现步骤摘要】
紫云英LHY基因及其应用
本专利技术涉及基因工程和植物遗传育种领域，具体地说，涉及紫云英LHY基因及其应用。
技术介绍
紫云英(AstragalussinicusL.)是豆科，黄耆属二年生草本植物，主要分布于中国长江流域，是重要的蜜源植物。紫云英对土壤资源的可持续利用，具有重要意义。成花是植物从营养生长向生殖生长的关键转换，同时也是是实现世代交替的中心环节，在很大程度上决定了植物繁殖的成功与否。紫云英按开花早晚可分特早花型、早花型、中花型和晚花型，开花时间直接决定了有效生长季的长短。作为绿肥，紫云英的种植和收获时间取决于主作物，保证紫云英产量的同时还要与主作物的生育期相协调。在合适的时间促使或避免开花，根据当地的耕作制度选育花期适当的品种是重要的育种目标。因此，成花基因研究对紫云英生长发育及遗传改良具有重要意义。但对于紫云英成花机制的研究，以及开花相关基因在此过程中的作用尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供紫云英LHY基因及其应用。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供紫云英LHY基因，LHY基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQIDNO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术利用RACE技术获得LHY基因的全长cDNA序列大小为2865bp(SEQIDNO:1)，含有一个2259bp的开放阅读框，5’和3’非编码区的长度分别为407bp和199bp。PolyA尾巴信号肽区域位于2854-2859bp处。第二方面，本专利技术提供含有所述LHY基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌或非可再生的植物部分。第三方面，本专利技术提供所述LHY基因或含有该基因的生物材料在调控植物开花时间中的应用。所述调控是指延迟开花时间。前述应用包括：1)使植物包含LHY基因；或者，2)使植物过表达LHY基因。所述应用包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。可选地，过表达LHY基因的方法选自以下1)～4)，或任选的组合：1)通过向植物中导入具有LHY基因的质粒；2)通过增加植物染色体上LHY基因的拷贝数；3)通过将强启动子与LHY基因可操作地连接；4)通过导入增强子。本专利技术中，所述植物为拟南芥、紫云英。进一步地，所述应用包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导等方法将包含LHY基因的重组表达载体导入植物，获得转基因植株。第四方面，本专利技术提供所述LHY基因或含有该基因的生物材料在植物育种中的应用。育种目的为延迟开花时间。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术首次从紫云英中克隆得到LHY基因，并通过农杆菌介导的遗传转化方法，在拟南芥中验证了LHY基因具有调控植物开花的功能，具体为延迟植株开花。转LHY基因的拟南芥株系出现抽薹延迟，开花延迟，抽薹天数比野生型平均晚18.36天，开花天数比野生型平均晚20.72。这表明紫云英LHY基因与成花关系密切，其具有调节开花时间的功能。将该基因应用于植物性状改良，具有良好的应用前景。本专利技术提供的LHY基因及其编码蛋白为培育植物新品种提供了宝贵资源。附图说明图1为本专利技术实施例1中紫云英LHY基因编码蛋白的氨基酸序列与其它九个物种的序列同源性比对结果。图2为本专利技术实施例1中LHY蛋白质二级结构预测及功能位点注释。图3为本专利技术实施例1中利用MEGA5.2构建的LHY基因氨基酸序列的NJ系统进化树(数字为置信度)。图4为本专利技术实施例1中预测的LHY蛋白的三维结构图及其与模板碳主链的重叠图。其中，A：紫云英LHY的三维结构图。B：紫云英LHY结构和质型多角体病毒RNA聚合酶蛋白的碳主链的重叠图。彩色结构的是紫云英LHY；紫色线是质型多角体病毒RNA聚合酶碳主链。图5为本专利技术实施例1中紫云英LHY基因5-RACEPCR电泳结果分析。其中，M:DL5000Marker：100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，5000；1：LHY5-RACEPCR电泳结果(约750bp)。图6为本专利技术实施例1中紫云英LHY基因3-RACEPCR电泳结果分析。其中，M:DL5000Marker：100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，5000；1：LHY3-RACEPCR电泳结果(约580bp)。图7为本专利技术实施例1中紫云英LHY基因3端第一步移基因PCR扩增结果。其中，M:DL5KDNAmarker：100，250，500，750，1000，15000，2000，3000，5000bp；1：LHY3端第一步移基因PCR扩增产物(约2000bp)。图8为本专利技术实施例2中转基因(紫云英LHY基因)拟南芥的表型分析结果。其中，左侧为野生型，右侧为转基因植株。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1紫云英LHY基因的克隆及序列分析本专利技术利用RACE技术从紫云英中获得LHY基因的全长cDNA序列大小为2865bp(SEQIDNO:1)，含有一个2259bp的开放阅读框，5’和3’非编码区的长度分别为407bp和199bp。PolyA尾巴信号肽区域位于2854-2859bp处。其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。具体方法如下：1、试验材料：新鲜紫云英组织样本。2、RNA提取：紫云英总RNA提取采用RNeasyPlantMiniKit(Qiagen货号：74904)进行，具体提取过程参照试剂盒说明书。3、5-RACE-PCR实验5-RACE模板采用GeneRacerTMKit(Invitrogen，货号：L1500-01)进行合成。(1)引物设计及序列采用PrimerPremier6.0软件进行5-RACE引物的设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。引物序列见表1。表15-RACE引物序列(2)5-RACEPCR反应体系及条件见表2～表5。表25-RACEPCR第一轮反应体系表35-RACEPCR第一轮反应条件表45-RACEPCR第二轮反应体系表55-RACEPCR第二轮反应条件(3)5-RACEPCR电泳结果PCR结束后，采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.紫云英LHY基因，其特征在于，LHY基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：/n(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；/n(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.紫云英LHY基因，其特征在于，LHY基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)SEQIDNO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。


2.含有权利要求1所述LHY基因的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌或非可再生的植物部分。


3.权利要求1所述LHY基因或含有该基因的生物材料在调控植物开花时间中的应用。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控是指延迟开花时间。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
1)使植物包含LHY基因；或者，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贤，王建红，曹凯，徐静，斯林林，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33