确定样品中完整微生物的浓度的方法技术

本发明专利技术涉及一种确定样品中完整微生物的浓度的方法以及设备、消耗物和试剂盒，该方法包括：任选地稀释样品的等分试样以提供处于稀释值的稀释等分试样；使该样品的等分试样或稀释等分试样的至少一部分与能够结合DNA的第一和第二染色剂接触，其中第一染色剂是荧光染色剂，是可渗透细胞的，并具有第一发射波长，并且第二染色剂是不可渗透细胞的，并能够在FRET对中充当受体分子，而所述第一染色剂充当供体分子；在第一发射波长下对等分试样‑染色剂混合物成像，并确定与成像的混合物中的完整微生物相对应的对象的数量的图像分析值；并将所述等分试样的图像分析值与预定校准曲线进行比较。

Method for determining the concentration of complete microorganisms in the sample

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】确定样品中完整微生物的浓度的方法本专利技术总体上涉及样品中微生物的检测和表征。特别地，本专利技术提供了一种用于测量样品中完整微生物的浓度的快速方法。特别地，完整微生物是活的。传统上，样品中微生物的生长和微生物的浓度是通过测量样品的光学参数(例如浊度)来确定的。例如，McFarland标准品在微生物学中用作样品浊度的参考，使得样品中的微生物(通常是细菌)的数量将处于给定的浊度范围内，并且此类标准品可用于浊度计中以确定样品中微生物的浓度。可以使用包括分光光度法的替代技术来确定样品中微生物的浓度。然而，尽管快速且容易实施，但这种技术仅能够估计样品中的微生物数量。浊度或特定波长的光的吸光度与样品中微生物浓度之间的关系也随不同的微生物种类而变化，因此当不清楚所讨论的微生物的类别时，很难估计微生物的浓度。此外，此类技术仅能够测量样品的总浊度或吸光度，因此无法区分样品中的活细胞(即有生命的细胞)和非活细胞(即死细胞)，或者实际上无法区分样品中的完整微生物或细胞或其他碎片。浊度测量样品中微生物的浓度也具有低灵敏度，并且为了能够测量样品中微生物的浓度，需要相对较高的微生物浓度。这种情况阻碍了以这种方式测量低浓度，并且在进行测量之前可能还需要延长培养步骤。还可以通过将样品的一部分(或稀释的一部分)铺在固体生长培养基上，孵育样品并计数形成的菌落数量来更定量地估计样品中的活微生物的数量。然而，这种技术的缺点在于，它需要漫长的孵育步骤，以便有足够的时间进行微生物的生长。因此，这样的经典技术可用于在特定的时间点测量样品中微生物的浓度，但是在需要迅速获知微生物的浓度的情况下用途有限，例如对需要事先了解样品中存在的微生物数量的样品中的微生物进行测试或确定。在微生物检测领域中众所周知，活的(即有生命的)细胞也可以与死细胞区分开，并且许多技术可用于此目的。本领域已知的方法集中于核酸染色剂、膜电位、氧化还原指示剂或报告基因。通常，这些技术依赖于以下事实：活微生物的膜完好无损，而死亡微生物的膜则被破坏和/或破裂(Gregori等,2001.Appl.Environ.Microbiol.67,4662-4670)。区分死细胞与活细胞的一种具体的技术是死/活染色技术。通过使用不可透过膜的染料或染色剂，只有膜破裂的细胞才被染色，而具有完整膜的细胞则不会。染料/染色剂因此用作死细胞的标志物，因为只有那些具有破损膜的细胞(即死细胞)才会被这种染色剂染色。以这种方式，可以检测死细胞，并且此外可以计算死细胞占总数的比例。该领域的进一步发展已导致使用两种单独的染色剂的技术发展：第一种是可渗透细胞的，可进入活细胞和死细胞。第二种是不渗透细胞的，只能进入死细胞。因此，可以对活细胞和死细胞进行差异标记，从而进行区分。用于执行此技术的试剂盒的一个例子是LIVE/DEADBacLight细菌活力试剂盒(Invitrogen)，其包含SYTO9(可渗透细胞)染色剂和碘化丙啶(PI)(不可渗透细胞)荧光染料。通过检测用于此类试剂盒的第一和第二种染色剂的发射波长处的微生物细胞，这样的技术在区分活微生物和死微生物细胞时特别有用，从而可确定样品中存在的活微生物的比例。可以使用许多不同的检测技术来区分样品中差异染色的活细胞和微生物细胞。例如，可以直接计数样品中被示为活的和非活的微生物细胞的数目，例如在显微镜视场中，以这种方式确定样品中存在的活微生物的比例。但是，这样的技术是劳动和时间密集的，并且不能准确地确定活微生物的浓度。当与活/死染色技术结合使用时，诸如流式细胞仪之类的自动化细胞计数方法也可用于测量样品中活微生物的比例(Berney等,2007.AppliedandEnvironmentalMicrobiology73,3283-3290)，然而，在流式细胞术方法中需要复杂且高度专业的仪器，并且需要定期校准(例如，在测量每个样品之前进行单独的校准)。因此，这样的技术通常不适合用于诸如常规临床实验室所需的稳定(robust)的检测方法中，并且这样的技术的自动化可能是困难的。因此，需要用于测量样品中完整微生物的浓度的方法和仪器，特别是用于临床的简单、快速和稳定的方法和仪器。如上所述，当使用合适的染色剂时，具有完整细胞膜的微生物可以与具有受损或破坏的细胞膜的微生物不同地染色。因此，通过活/死染色检测活细胞通常包括检测具有完整细胞膜的细胞，因此出于测量样品中活微生物细胞浓度的目的，具有完整细胞膜的细胞被认为代表活细胞。完整细胞与存活细胞之间的相关性很好，因此利用差异染色为直接确定存活细胞的浓度提供了直接而快速的方法，而无需进行通常包括漫长的孵育步骤的直接活力测定。在某些情况下，据报道，虽然在活/死染色试验中显示为“存活”的一部分微生物细胞可能包含完整的细胞膜，但事实上它们可能在代谢上是无活性的或者是不可培养的(Trevors2012.JMicrobiolMeth90,25-8)。此外，在营养丰富的环境中快速指数生长期间，可能会降低存活微生物细胞的膜完整性，从而使第二种荧光染色剂进入细胞(Shi等,2007.CytomPartA71A,592-298)。因此，这样的细胞将以第二发射波长发射光，并且由于第二荧光染色剂具有淬灭第一荧光染色剂的荧光的能力，因此可以减少这种细胞在第一发射波长下的荧光。此外，诸如褪色以及第一(可渗透细胞的)荧光染色剂的吸收高于预期的问题可能会影响此类方法的准确性(Stiefel等,2015.BMCMicrobiology15:36)。但是，这些因素并未被认为会显著影响确定样品中存活微生物的数量或浓度的方法的结果，检测完整细胞被认为是检测待测样品中存活细胞的数量或浓度的有效方法。实际上，本专利技术人已经表明，如下文进一步描述的，可以使用这样的染色方法来提供样品中活微生物的浓度的指示。如上所述，在微生物学中的许多情况下，希望确定微生物的浓度，尤其是活微生物的浓度。可能希望允许提供适当浓度或数量的微生物以用于表征微生物的测定，从而可以正确进行所述测定，或者实际上确保样品适合用于特定测定。值得注意的是，这可能包括标准(或标准化)培养物或培养物的接种物的制备。这尤其包括用于抗生素敏感性试验(AST)的标准接种物的制备，出于临床目的，在检测和鉴定微生物感染时需要已知浓度或预定浓度或标准浓度的接种物。然而，也可能需要确定样品中微生物的浓度，或为下文将详细讨论的其他测定提供标准培养物。生物学和医学中的许多过程都需要准确测定样品中微生物(特别是活微生物)的数量，并根据所述确定方法制备接种物。这些包括，例如，水和食品质量控制分析、监测环境样品中的微生物、医疗设备或患者体内或表面的生物膜形成、以及实验室微生物研究。特别地，准确确定样品中活微生物细胞的浓度，并由此制备含有期望浓度的微生物的接种物可用于诊断微生物感染。微生物感染是人类和动物疾病的主要类别，具有重大的临床和经济意义。尽管可以使用各种类型和类型的抗微生物剂来治疗和/或预防微生物感染，但是抗微生物剂耐药性是现代医学中的一个大且日益严重的问题。因此，在治疗微生物感染的背景下，希望并确实很重要的一点是，获得有关感染微生物的性质及其抗微生物敏感性的信息，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定样品中完整微生物的浓度的方法，所述方法包括：/na.提供含有微生物的样品；/nb.任选地稀释所述样品的等分试样以提供处于稀释值的稀释等分试样；/nc.使步骤(a)的所述样品的等分试样的至少一部分或在稀释步骤(b)期间或之后的所述样品的稀释等分试样的至少一部分与能够结合DNA的第一和第二染色剂接触以提供样品-染色剂混合物，其中所述第一染色剂是荧光染色剂，是可渗透细胞的，并具有第一发射波长，并且所述第二染色剂是不可渗透细胞的，并且能够在FRET对中充当受体分子，而所述第一染色剂充当供体分子；/nd.在所述第一发射波长下对步骤(c)的等分试样-染色剂混合物进行成像，并确定与成像的混合物中的完整微生物对应的对象的数量的图像分析值；以及/ne.将所述等分试样的所述图像分析值与预定校准曲线进行比较，从而确定所述样品中完整微生物的浓度。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171013 GB 1716883.21.一种确定样品中完整微生物的浓度的方法，所述方法包括：
a.提供含有微生物的样品；
b.任选地稀释所述样品的等分试样以提供处于稀释值的稀释等分试样；
c.使步骤(a)的所述样品的等分试样的至少一部分或在稀释步骤(b)期间或之后的所述样品的稀释等分试样的至少一部分与能够结合DNA的第一和第二染色剂接触以提供样品-染色剂混合物，其中所述第一染色剂是荧光染色剂，是可渗透细胞的，并具有第一发射波长，并且所述第二染色剂是不可渗透细胞的，并且能够在FRET对中充当受体分子，而所述第一染色剂充当供体分子；
d.在所述第一发射波长下对步骤(c)的等分试样-染色剂混合物进行成像，并确定与成像的混合物中的完整微生物对应的对象的数量的图像分析值；以及
e.将所述等分试样的所述图像分析值与预定校准曲线进行比较，从而确定所述样品中完整微生物的浓度。


2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述样品的等分试样稀释以提供处于稀释值的稀释等分试样，其中接触步骤(c)在稀释步骤(b)期间或之后进行，并且其中步骤(c)-(e)在所述稀释等分试样上进行。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述方法包括稀释所述样品的等分试样以提供处于不同稀释值的两个或更多个稀释等分试样，其中，所述两个或更多个等分试样在步骤(c)之前或期间同时制备，或者依次进行制备，其中在步骤(d)和/或(e)之后制备第二或进一步的稀释等分试样。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在处于不同稀释值的两个或更多个等分试样上进行步骤(c)和(d)，并且其中步骤(e)包括鉴定包括在预定校准曲线的范围内的图像分析值的等分试样，并将所述等分试样的图像分析值与所述预定校准曲线进行比较，从而确定所述样品中的活微生物的浓度。


5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(c)和(d)在每个等分试样上同时进行。


6.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(c)和(d)在每个等分试样上依次进行。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述第二染色剂具有比所述第一染色剂更高的DNA结合亲和力，使得所述第二染色剂能够从DNA上置换所述第一染色剂。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括检测所述第二染色剂。


9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述方法包括检测所述第二染色剂。


10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(d)包括对每个等分试样-染色剂混合物同时成像以检测所述第一和第二染色剂。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述样品包括包含在生长培养基中的微生物。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中接触所述样品的等分试样或所述样品的稀释等分试样或其一部分之前，将所述第一和第二染色剂预混合以形成染色液。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述第一荧光染色剂在所述第一发射波长处的荧光强度在所述染色剂与核酸结合时被增强。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述第一荧光染色剂具有在350-700nm的波长范围内的激发波长和发射波长。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述第一荧光染色剂是绿色荧光染色剂。


16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述第一荧光染色剂是不对称花菁染料。


17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中，所述绿色荧光染色剂是SYTO染色剂。


18.根据权利要求16所述的方法，其中所述SYTO染色剂是SYTOBC。


19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述第二染色剂是荧光染色剂。


20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述第二染色剂是红色荧光染色剂。


21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述红色荧光染色剂是碘化丙啶。


22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，所述成像是对微生物的悬浮液进行的。


23.根据权利要求22所述的方法，其中，通过所述悬浮液在一个或多个焦平面处获得图像。


24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中，所述成像包括沿着光轴获得一系列2-D图像，其中，每个图像是沿着所述光轴在不同位置处通过一体积的所述悬浮液获得的。


25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，与所述染色剂接触的步骤(c)在大于4℃的温度下进行。


26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)的接触中，将所述等分试样或稀释等分试样或其一部分与所述第一和第二染色剂一起孵育1至20分钟的时间段。


27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的所述成像在室温下进行。


28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中，在成像步骤(d)中，鉴定所述微生物是聚集的还是非聚集的，并且使用针对聚集的或非聚集的微生物而预定的校准曲线。


29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中，分析所述图像的荧光强度和/或每个枚举对象的大小，以及可选地每个枚举对象的形态。


30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中，分析所述图像的最大荧光强度、中值荧光强度和/或每个枚举对象的面积。


31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中，分析所述图像的最大、中值和/或平均荧光强度和/或对象群的面积。


32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中确定活微生物的浓度。


33.一种确定样品中微生物的抗微生物敏感性的方法，所述方法包括：
(i)提供含有活微生物的样品；
(ii)对所述样品进行根据权利要求1-32中任一项所述的步骤(b)至(e)，以确定所述样品中完整微生物细胞的浓度；
(iii)使用在步骤(i)中的样品接种一系列测试微生物培养物进行抗生素敏感性测试(AST)，其中所述一系列测试微生物培养物包含至少两种不同的生长条件，其中所述不同的生长条件包含一种或更多种不同的抗微生物剂，并且每种抗微生物剂均以两种或更多种不同的浓度进行测试；并且
(iv)评估在每种生长条件下微生物的生长程度；
其中，如果需要，将所述样品或所述测试微生物培养物中微生物细胞的浓度调节至所需或预定浓度；并且
其中，在每种生长条件下微生物的生长程度用于确定至少一种抗微生物剂的至少一个MIC值，从而确定所述样品中所述微生物的抗微生物敏感性。


34.根据权利要求33所述的方法，其中，基于步骤(ii)中确定的浓度，调节步骤(i)的至少一部分样品的浓度，以提供用于接种步骤(iii)中的测试微生物培养物的接种物。


35.根据权利要求33或34所述的方法，其中，调节浓度的步骤包括基于步骤(ii)中确定的浓度的稀释液。


36.根据权利要求35所述的方法，其中在步骤(ii)之后，将步骤(i)的至少一部分样品稀释以提供用于步骤(iii)的接种物。


37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中，在所述接种的微生物测试培养物中的微生物浓度在4.5×105±80％或5×105±60％的范围内。


38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中，所述测试微生物培养物中的至少一种包括苛养培养基。


39.根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其中，所述浓度调节包括培养或进一步培养所述样品。


40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法，其中，如果所述样品中的微生物浓度低于1×106个微生物，则不对所述样品进行AST测定。


41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中，通过从样品中回收微生物来提供微生物样品，从而提供回收的微生物样品。


42.一种用于确定样品中完整微生物的浓度的设备，所述设备包括：
a.用于接收含有微生物的样品的容器；
b.样品等分装置，用于从所述样品中取出样品等分试样；
c.包含第一染色剂和第二染色剂的染色剂储存器，或包含第一染色剂的第一染色剂储存器和包含第二染色剂的第二染色剂储存器，其中所述第一染色剂是荧光染色剂，是可渗透细胞的，并具有第一发射波长，并且所述第二染色剂是不可渗透细胞的，并且能够在FRET对中充当受体分子，而所述第一染色剂充当供体分子；
d.第一成像装置，其可操作用来在第一发射波长下对所述样品等分试样和所述第一和第二染色剂的混合物进行成像；以及
e.处理器，其可操作用来确定与成像的混合物中的完整微生物对应的对象的数量的图像分析值，并将所述图像分析值与预定校准曲线进行比较，从而确定所述样品中完整微生物的浓度。


43.根据权利要求42所述的设备，其被配置为执行...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔纳斯·贾维斯，扬·格拉维，马库斯·克林特斯特，
申请(专利权)人：Q莱纳公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE