鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及方法技术

本发明专利技术涉及生物毒株鉴别技术领域，具体公开了鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及方法，提取待鉴别病毒DNA，采用本发明专利技术设计的引物进行第一步扩增，扩增出两条条带的为变异株或HB98疫苗毒株，扩增出1条条带的为经典毒株；扩增出两条条带的病毒DNA再进行第二步扩增，扩增产物分子量大小为211bp的为变异株,扩增产物分子量大小为293bp的为HB98疫苗毒株。第一步PCR的敏感度可以达到10TCID

PCR primers and methods for identification of PRV variant strains

【技术实现步骤摘要】
鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及方法
本专利技术涉及生物毒株鉴别
，特别涉及鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物及检测方法。
技术介绍
伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus,PRV)是疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科的双股DNA病毒，基因组在140kd左右，编码69个开放阅读框。该病毒主要引起母猪流产、死胎及呼吸系统症状，仔猪出现神经症状和腹泻，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前，欧美洲很多国家通过免疫接种和净化技术已经根除该病。我国近十多年内通过采用强化免疫和净化技术，该病也得到有效控制。但是，2011年末，我国PRV疫苗免疫猪场再次暴发该病。全基因组分析结果也表明，此次新发的伪狂犬病病毒与之前的经典伪狂犬病毒属于不同的亚群，其抗原性发生了变化，变异毒株位于一个新的基因分支。因此建立PRV变异毒株和经典毒株鉴别方法十分必要。目前现有的检测伪狂犬病毒感染的PCR方法有很多，其中最常用的两种是国标法与伪狂犬gE基因检测法。国标法主要针对伪狂犬病毒gD基因，可以特异的扩增出220bp的片段。因为gD基因是伪狂犬病毒感染过程中一个重要的囊膜蛋白，包括疫苗毒与野毒在内的各种类型的伪狂犬病毒(gD缺失的伪狂犬病毒除外)都存在该基因，所以该方法可以用于鉴别伪狂犬病毒的感染与否，但不能够区分疫苗毒与野毒株。而伪狂犬病毒gE基因检测法主要用于鉴别疫苗毒与野毒株，野毒株可以扩增出632bp的片段，而疫苗毒由于缺失了gE基因，所以不能扩增出相应的片段。因为现阶段猪场都有Bartha-K61等疫苗免疫，所以国标方法不再适合进行鉴别，而用于区分疫苗毒与野毒的伪狂犬病毒gE基因检测法得到了很好的应用，但是由于伪狂犬病毒变异毒株的出现，使这一方法受到了局限。该方法不能够区分出变异毒株与经典毒株，而变异毒株与经典毒株的区分在免疫与监测上又至关重要，所以需要一种可以有效区分伪狂犬病毒经典毒株与变异毒株的PCR诊断方法。
技术实现思路
为了有效的预控伪狂犬病的发生，区分出经典毒株与变异毒株的感染及其流行的区域至关重要。本研究通过不同毒力毒株全基因组序列比对，找到了经典毒株与变异毒株的基因差异区域UL44和UL36，设计PCR引物，建立了两步法PCR，具有较高特异性和敏感性，可用于鉴别PRV经典毒株与变异毒株，为该病诊断提供了有效方法。本专利技术的技术方案包括以下内容：用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物组，该PCR引物组包括引物1F-C、1F-V、1R、2F和2R，其中各引物的序列如下：1F-C：5’-ACGCCGACCCCGAGTACTTTGACG-3’，1F-V：5’-GAGCCCGTCTCGGGGACGAC-3’，1R：5’-GGCCACGCGCACGGACACC-3’，2F:5’-GATGCGGTCACCGTCGGGTTT-3’，2R:5’-CCGCCGCTCAGCCCCCATCGT-3’。上述的PCR引物组在鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株中的应用，包括以下步骤：提取待鉴别病毒DNA，使用所述PCR引物组中的引物1F-C、1F-V、1R进行第一步扩增，扩增出两条条带的为变异株或HB98疫苗毒株，扩增出1条条带(178bp)的为经典毒株；扩增出两条条带(178bp、467bp)的病毒DNA再使用所述PCR引物组中的引物2F和2R进行第二步扩增，扩增产物分子量大小为211bp的为变异株，扩增产物分子量大小为293bp的为HB98疫苗毒株。通过对中国新流行伪狂犬病毒变异毒株与国内外经典毒株全基因组序列比对发现，在UL44区域内，变异毒株比经典毒株多插入了21个碱基的序列。鉴此，首先设计了3条引物的PCR方法，一条下游引物，两条上游引物。理论上，经典毒株只能与一条上游引物和下游引物结合，产生一条约178bp的条带；而变异毒株(包括HB98毒株，序列近似EA毒株)可以与两条上游引物和下游引物结合，产生一条约467bp的条带和一条178bp左右的条带。由此可以区分出伪狂犬病毒经典毒株与变异毒株。但是，我们在检测疫苗毒株时发现，HB98毒株也出现两条条带，基因序列测定结果显示，HB98毒株UL44也存在着21个碱基的插入。我们在UL36区域内又设计了一对引物，通过第二次PCR，HB98扩增出293bp条带，变异毒株扩增出211bp的条带，从而可以有效区分HB98与变异毒株，结果证明，通过以上两次PCR可以有效地区分伪狂犬变异毒株与经典毒株。上述的PCR引物组在制备用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的试剂盒中的应用。一种用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的试剂盒，该试剂盒中包含上述的PCR引物组。一种鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的方法，提取待鉴别病毒DNA，使用上述PCR引物组中的引物1F-C、1F-V、1R进行第一步扩增，扩增出两条条带的为变异株或HB98疫苗毒株，扩增出1条条带的为经典毒株；扩增出两条条带的病毒DNA再使用上述PCR引物组中的引物2F和2R进行第二步扩增，扩增产物分子量大小为211bp的为变异株，扩增产物分子量大小为293bp的为HB98疫苗毒株。上述的方法，优选的，第一步扩增的反应体系：Taqmix12.5μl，蒸馏水7.5μl，DMSO1μl，10uM的上游引物1F-C、下游引物1F-V、鉴别引物1R各1μl，DNA模板1μl。上述的方法，优选的，第一步扩增的反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸10min。上述的方法，优选的，第二步扩增的反应体系：Taqmix12.5μl，蒸馏水8.5μl，DMSO1μl，10uM上游引物F’、下游引物R’分别为1μl、1μl，DNA模板1μl。上述的方法，优选的，第二步扩增的反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃终延伸10min。上述的方法，第一次扩增的敏感度达到10TCID50病毒量或0.01ng/ml质粒量；第二次扩增的敏感度达到10TCID50病毒量或者0.1ng/ml质粒量。本专利技术PCR鉴别方法，准确率达到90％到100％。区分经典毒株与变异毒株的原则是：第一次PCR，如果扩增产物只有178bp一个条带，则为经典PRV毒株，如果扩增产物含有467bp和178bp两个条带，则为变异毒株或HB98疫苗毒株。如果出现两个条带，则需要进行第二步PCR。如果第二次PCR扩增产物大小为211bp，则为变异毒株，如果扩增产物大小为293bp，则为HB98疫苗毒株。该判断方法简便易行。本专利技术的有益效果：1)第一步PCR的敏感度可以达到10TCID50病毒量或0.01ng/ml质粒量，而第二步PCR敏感度达到10TCID50病毒量或者0.1ng/ml质粒量。该敏感度可以有效的检测出临床病料中是否有伪狂犬病毒感染，并区分出伪狂犬病毒经典毒株或者变异毒株感染；2)通过与国标检测方法和常规的PCR方法进行比较本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物组，其特征在于，该PCR引物组包括引物1F-C、1F-V、1R、2F和2R，其中各引物的序列如下：/n1F-C：5’-ACGCCGACCCCGAGTACTTTGACG-3’，/n1F-V：5’-GAGCCCGTCTCGGGGACGAC-3’，/n1R：5’-GGCCACGCGCACGGACACC-3’，/n2F:5’-GATGCGGTCACCGTCGGGTTT-3’，/n2R:5’-CCGCCGCTCAGCCCCCATCGT-3’。/n

【技术特征摘要】
1.用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的PCR引物组，其特征在于，该PCR引物组包括引物1F-C、1F-V、1R、2F和2R，其中各引物的序列如下：
1F-C：5’-ACGCCGACCCCGAGTACTTTGACG-3’，
1F-V：5’-GAGCCCGTCTCGGGGACGAC-3’，
1R：5’-GGCCACGCGCACGGACACC-3’，
2F:5’-GATGCGGTCACCGTCGGGTTT-3’，
2R:5’-CCGCCGCTCAGCCCCCATCGT-3’。


2.权利要求1所述的PCR引物组在鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株中的应用，其特征在于，提取待鉴别病毒DNA，使用所述PCR引物组中的引物1F-C、1F-V、1R进行第一步扩增，扩增出两条条带的为变异株或HB98疫苗毒株，扩增出1条条带(178bp)的为经典毒株；扩增出两条条带(178bp、467bp)的病毒DNA再使用所述PCR引物组中的引物2F和2R进行第二步扩增，扩增产物分子量大小为211bp的为变异株，扩增产物分子量大小为293bp的为HB98疫苗毒株。


3.权利要求1所述的PCR引物组在制备用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的试剂盒中的应用。


4.一种用于鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1所述的PCR引物组。


5.一种鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的方法，其特征在于，提取待鉴别病毒DNA，使用权利要求1所述PCR引物组中的引物1F-C、1F-V...

【专利技术属性】
技术研发人员：白娟，吕林，姜平，王先炜，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32