一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术属于动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，公开了猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法，根据设计的PCV4、PCV3病毒基因组序列所得的试剂盒和相应的检测方法具有灵敏度高、特异性好、稳定性高，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，能彻底解决PCV4、PCV3引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，具体涉及一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法。
技术介绍
猪圆环病毒4型(Porcinecircovirustype2,PCV4)是一种由湖南大学的研究人员发现一种新型的猪圆环病毒，研究人员对187个样品的患病率调查表明，PCV4的患病率约为12.8％。病毒基因组的大小为1770个核苷酸。PCV4与水貂圆环病毒的基因组一致性最高(66.9％)，与其他PCV基因组的一致性为43.2％-51.5％。猪圆环病毒3型(PCV3)由Palinski等2016年首次鉴定并命名。同年3月，在中国辽宁、江西、重庆的3个猪场检测出了PCV3病原。研究认为，PCV3是一种与母猪皮炎肾病综合征和繁殖障碍相关的病原，但目前尚未清楚其起源，是否早已存在于猪体中只是未被发现，还是通过跨物种传播或通过PCV间的重组而形成，仍有待进一步探究。自2016年以来，我国部分省(市)相继出现以母猪流产和死亡、断奶仔猪呼吸衰竭和死亡为临床特征的PCV3感染报道。国内有研究从广西腹泻病死仔猪的病料样品中检测出PCV3，表明PCV3不但引起母猪皮炎肾病综合征与繁殖障碍，还能引起仔猪腹泻。咸阳职业技术学院畜牧兽医研究所从96个猪场样本中进行PCV3检测，将阳性样品进行序列测定分析，同时对PCV3阳性样本进行6种常见猪群病毒病检测。结果检测出了PCV3阳性样品8份，阳性率为8.33％。其中7份样品与其他6种常见猪群病毒病存在不同程度的混合感染现象，混合感染率87.5％。序列分析表明，陕甘地区猪场8株PCV3基因片段核苷酸同源性在98.3％～100％之间，与不同地域参考毒株同源性在97.6％～100％之间。结果显示，陕甘地区2015年样本中即存在PCV3感染，不同地区的PCV3基因同源性高，PCV3遗传稳定，基因进化树显示不同地域PCV3毒株交叉分布，没有显著的地域特征。由于PCV4是一种新型的猪圆环病毒，目前未见快速检测PCV4病原的公开报道，因此，专利技术一种快速鉴别PCV4和PCV3感染的诊断试剂盒，为临床快速确诊相应疾病，具有重要的现实意义。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法，该猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床确诊PCV4和PCV3感染提供有力的技术手段。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现。(一)一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAisoReagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、PCV4-F上游引物、PCV4-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为PCV4和PCV3阳性质粒混合物。优选的，PCV4-F上游引物的序列为：5’-GGAAGGAGGTCGGAGAAA-3’；PCV4-R下游引物的序列为：5’-GCAACCAGCCATAATAGTCAT-3’；PCV3-F上游引物的序列为：5’-CAGCTCGGTGAAGCGCTTAC-3’；PCV3-R下游引物的序列为：5’-TACTGCAGGCATCTTCTCC-3’。优选的，所述裂解液的成分为DNAisoReagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCRBuffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1PCV4-F上游引物、25μmol·L-1PCV4-R下游引物、25μmol·L-1PCV3-F上游引物、25μmol·L-1PCV3-R下游引物和5U/μLrTaqDNA聚合酶，每个反应体积比为15.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰1.0︰1.0︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为PCV4和PCV3阳性质粒混合物，20个反应共计40.0μL，装成1管。(二)一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：步骤1，DNA提取子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管(EP管)，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；步骤2，PCR扩增反应子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物；子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述阴性对照样品提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入PCV4和PCV3阳性质粒混合物，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；步骤3，电泳检测通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断。优选的，子步骤1.1中，所述待检样品为组织病料样品、血清样品或全血样品。进一步优选的，所述组织病料样品为肺脏、肝脏或脾脏。优选的，步骤2中，所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、PCV4-F上游引物、PCV4-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaqDNA聚合酶。进一步优选的，所述PCV4-F上游引物的序列为：5’-GGAAGGAGGTCGGAGAAA-3’；所述PCV4-R下游引物的序列为：5’-GCAACCAGCCATAATAGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PCV4-F上游引物、PCV4-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为PCV4和PCV3阳性质粒混合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAisoReagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、PCV4-F上游引物、PCV4-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为PCV4和PCV3阳性质粒混合物。


2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，PCV4-F上游引物的序列为：5’-GGAAGGAGGTCGGAGAAA-3’；
PCV4-R下游引物的序列为：5’-GCAACCAGCCATAATAGTCAT-3’；
PCV3-F上游引物的序列为：5’-CAGCTCGGTGAAGCGCTTAC-3’；
PCV3-R下游引物的序列为：5’-TACTGCAGGCATCTTCTCC-3’。


3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述裂解液的成分为DNAisoReagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCRBuffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1PCV4-F上游引物、25μmol·L-1PCV4-R下游引物、25μmol·L-1PCV3-F上游引物、25μmol·L-1PCV3-R下游引物和5U/μLrTaqDNA聚合酶，每个反应体积比为15.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰1.0︰1.0︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为PCV4和PCV3阳性质粒混合物，20个反应共计40.0μL，装成1管。


4.一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：
步骤1，DNA提取
子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；
子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；
步骤2，PCR扩增反应
子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，7...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱小甫，吴旭锦，
申请(专利权)人：咸阳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：陕西;61